Todos os pacientes e crianças do grupo de controle foram encaminhados para ecocardiografia (Sistema Philips, modelo HD7.XE, Amsterdã). A avaliação foi feita com vários transdutores que variam de 3,5 a 7 MHZ com registro eletrocardiográfico simultâneo para possibilitar tempo de fluxo. Foi usada a ecocardiografia modo M e 2D na posição lateral supina e esquerda para estimar a pressão pulmonar e determinar o diâmetro das câmaras cardíacas.
O modo M foi feito do eixo curto paraesternal do ventrículo esquerdo ao aplicar a linha do cursor perpendicular no nível médio papilar para estimar o que segue: dimensões internas do ventrículo esquerdo no fim da sístole e diástole (LVESD, LVEDD) respectivamente, fração de encurtamento (% FS), fração de ejeção (% EF), diâmetro do ventrículo direito (VD), espessamento da parede posterior (PP), espessamento da parede septal, diâmetro da aorta (DA) e diâmetro do átrio direito (AD). O valor normal do % EF varia de faixas etárias de 55-65% nas crianças.
O Doppler de onda pulsada do fluxo das válvulas mitral e tricúspide foi obtido das vistas apicais de quatro e cinco câmaras com amostra de volume posicionada na ponta das valvas mitral e tricúspide, a velocidade de influxo transmital e tricúspide foi traçada e foram medidas as velocidades disastólica precoce (E), diastólica tardia (A) e a razão E/A. O estudo do Doppler contínuo das válvulas pulmonares e aórticas foi feito para avaliar o gradiente pressórico sistólico em todas as válvulas pulmonares e aórticas. A pressão arterial pulmonar sistólica foi calculada ao obter o gradiente sistólico máximo da regurgitação tricúspide e acrescentando o valor da pressão atrial direita. A HAP é definida como a média da pressão arterial pulmonar > 25 mm Hg em todas as faixas etárias.10
Foram coletados 5 mL de amostras de sangue venoso de cada indivíduo, em uma condição asséptica completa, em tubos Vacutainers com gel separador. As amostras de soro foram obtidas após coagulação ao colocá-las em água a 37 °C por 20 minutos e serem então centrifugadas a 3.000 rpm por cinco minutos. O soro obtido foi dividido em dois tubos, um foi armazenado a -70 °C para análises do VEGF e o segundo foi analisado para ferritina no soro.
A avaliação de VEGF no soro foi feita com os Kits Elisa VEGF para Humanos (Elabscience Biotechnology Co, Ltd, EUA). O limite de detecção do ensaio VEGF foi 9 pg/mL, a precisão intraensaio foi ≤ 6 e a precisão interensaio foi ≤ 10%. A ferritina sérica foi medida com o método de ensaio imunossorvente ligado à enzima (Elisa) (Padian Elm Co, Ltd, EUA). Foram avaliadas as investigações laboratoriais de rotina, como hemograma completo, testes da função hepática e renal.
A análise estatística foi feita com a versão 19.0 do Pacote Estatístico para as Ciências Sociais (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Os dados quantitativos foram expressos como média ± DP. As diferenças entre os dois grupos foram analisadas com o teste t de Student e o teste U de Mann Whitney independentes. A diferença entre mais de dois grupos foi avaliada com a análise de variância unidirecional (Anova) e as diferenças entre os subgrupos foram analisadas pelo teste de diferença mínima significativa post hoc (DMS). Os dados não programáticos foram comparados com o teste qui-quadrado. As correlações entre os grupos foram feitas com os coeficientes de correlação de Spearman. As curvas da característica de operação do receptor (ROC) foram usadas para identificar os pontos de corte ideais dos níveis séricos do VEGF na presença de HAP. Foi feita a análise de regressão logística para determinar os fatores de risco para HAP em crianças com talassemia beta maior. O valor de p < 0,05 foi significativo e no teste de DMS foi significativo se < 0,01.