Produção de etanol a partir de torta de mamona (Ricinus communis L.) e avaliação da letalidade da torta hidrolisada para camundongos
http://dx.doi.org/10.1590/S0100-40422008000500031
Ethanol production from castor bean cake (Ricinus communis L.) and evaluation of the lethality of the cake for mice
Walber Carvalho MeloI; Daniele Barreto da Silva e Nei Pereira Jr.I, *; Lídia Maria Melo Santa AnnaII; Alexandre Soares dos SantosIII
IDepartamento de Engenharia Bioquímica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, CP 68542, 21949-900 Rio de Janeiro - RJ, Brasil
IIGerência de Biotecnologia e Tratamentos Ambientais, CENPES/PETROBRAS, Av. Jequitibá, 950 , Cidade Universitária, Ilha do Fundão, 21949-900 Rio de Janeiro - RJ, Brasil
IIIDepartamento de Ciências Básicas, Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, Rua da Glória, 187, 39100-000 Diamantina - MG, Brasil
The castor bean cake is rich in starch (48 ± 0.53%) and bears a problem linked to the occurrence of a toxic protein (ricin). The chemical hydrolysis (ratio solid:liquid = 1:6; H2SO4= 0.1 mol L-1; 120 °C; 40 min) generated a medium with 27 g L-1 of reducing sugars (hydrolysis efficiency= 32%). The hydrolyzed product was fermented and produced 11 g L-1 of ethanol (volumetric productivity=1.38 g L-1 h-1 and ethanol yield on substrate consumed=0.45 g g-1). In vivo experiments (DL50) revealed a reduction of roughly 240 times in the CBC toxicity (2.11 µg g-1).
Keywords: castor bean cake; acid hydrolysis; ethanol.
A pesquisa e o desenvolvimento no setor de combustíveis obtidos de fontes renováveis são responsáveis por uma crescente demanda por biomassas de origem vegetal.1 O uso de sementes de mamona (Ricinus communis L.) para extração de óleo e emprego na produção de biodiesel é responsável pela geração diária de toneladas de um resíduo sólido proveniente da prensagem das sementes, a torta de mamona.2 Esse resíduo possui alto teor de proteínas e é produzido na proporção de 1,2 t por tonelada de óleo extraído,3 o que corresponde a 55% do peso médio das sementes, valor que pode variar de acordo com o teor de óleo da semente e do processo industrial de extração do óleo. Segundo algumas projeções, espera-se uma produção de até 20000 t anuais de torta de mamona associada à indústria do biodiesel.4 Esse resíduo, embora rico em proteínas, não pode ser usado na alimentação animal e exige cuidados com a manipulação devido à toxicidade atribuída a peptídeos alergênicos presentes nas sementes.5 Por outro lado, a torta de mamona traz consigo potencial emprego na geração de bioetanol, por conta de seu alto teor de amido.6
A cultura da mamona sempre foi considerada uma atividade de pequenos produtores, especialmente na região de clima semi-árido do Brasil. No entanto, algumas ações do governo brasileiro vêm mudando esse cenário. Através de estímulos para a cultura da mamona no Nordeste do Brasil, o governo pretende criar condições para o desenvolvimento da região. Nesta parte do Brasil, há quase 4 milhões de ha com características edafo-climáticas apropriadas, onde se alcançaria o rendimento de até 1,5 t de sementes por hectare, enquanto a média anual é de apenas 750 kg.4
O uso da torta de mamona como matéria-prima para produção de bioetanol atende a uma tendência de integração dos processos de obtenção de etanol e biodiesel, pois de acordo com estudos em andamento no CENPES/Petrobras sobre o processo de transeste-rificação do óleo de mamona em biodiesel, se forem gerados 160 L de etanol para cada 1000 kg de torta de mamona produzida com a prensagem das sementes, o processo de conversão química do óleo extraído em ésteres etílicos tornar-se-ia auto-suficiente em relação à demanda de etanol. Ademais, o uso da torta ainda observa as Diretrizes de Política de Agroenergia 2006-2011 brasileiras (Ministérios da Agricultura, das Minas e Energia e da Ciência e Tecnologia; versão 0.01 de 6/10/2006), que demandam por aproveitamento e valorização dos resíduos da indústria do biodiesel, elevando à condição de co-produto o resíduo da extração do óleo das sementes de mamona.
Com vistas ao aproveitamento da torta de mamona como fonte de açúcares fermentáveis para produção de bioetanol e à formulação de tratamento adequado para a destoxificação deste resíduo para uso como matéria-prima na indústria de ração, é apresentado neste trabalho resultado de fermentabilidade do mosto obtido por sacarificação química do amido da torta de mamona e análises de toxicidade (expressa em DL50) do resíduo sólido gerado sob condições pré-estabelecidas.7
Esta biomassa foi fornecida pela Petróleo Brasileiro S.A. (Petrobras). O resíduo sólido triturado, obtido de processos de produção de biodiesel, passou por secagem durante 24 h sob temperatura de 60 °C em estufa.
Análise do teor de amido da torta de mamona
O percentual de amido presente na biomassa foi determinado, em base seca, de acordo com a metodologia enzimático-colorimetríca para determinação de amido em grãos que contêm amilose e amilopectina.8,9 Amostra com 1,0 g de massa foram submetidas, em triplicata à hidrólise enzimática e o teor de amido foi calculado com base na quantificação da glicose liberada.
Obtenção do hidrolisado ácido
A hidrólise química em triplicata foi realizada em frascos cônicos de 250 mL contendo 10,0 g de torta de mamona seca e solução de H2SO4 0,25 mol L-1 (relação sólido-líquido 1:6) . O processo hidrolítico transcorreu durante 40 min a 121±2 °C em autoclave de 4000 W (Fabbe-Primar®, Brasil). Essas condições experimentais são decorrentes de estudos de hidrólise da torta com uso de metodologia multivariada, onde foram avaliados os efeitos de tempo, temperatura, razão sólido/líquido e concentração de ácido.7
Análise de toxicidade (DL50 %) da torta de mamona e do resíduo sólido após a hidrólise
As análises da toxicidade por determinação da DL50, tanto para a torta in natura quanto para o resíduo sólido derivado do processo hidrolítico, foram realizadas em camundongos Suíços brancos SW-55. Os resíduos sólidos avaliados foram triturados em gral de vidro. Massas correspondentes a 5,0000 ± 0,0050 g de cada amostra foram transferidas quantitativamente para frascos de erlenmeyer com auxílio de 80 mL de solução salina estéril pH 6,5-7,2. Após processo de dissolução em ultra-som, por 30 min, as suspensões foram mantidas em repouso, por uma noite, sob refrigeração a 4 °C para decantação dos sólidos. O sobrenadante de cada frasco foi filtrado individualmente através de papel de filtro Whatman nº 1 e os filtrados, recolhidos em frascos erlenmeyers com tampa. Aos sólidos decantados foram adicionados mais 20 mL de solução salina, centrifugados 2 vezes em centrífuga analítica por 15 min a 1300 rpm e recolhidos os sobrenadantes obtidos, após filtração, em seus respectivos frascos. O pH dos filtrados, quando necessário, foi corrigido para a faixa de 6,5 a 7,2. As amostras filtradas foram diluídas (10-1, 10-2, 10-3 e 10-4), novamente filtradas em filtro Millipore RC 25 0,45 µ e inoculadas em volumes de 0,2 mL por via intra-peritoneal em lotes de 10 animais. As mortes dos animais foram registradas nos períodos de 48 e 96 h. O número total de animais utilizados no foi de 210 camundongos com peso médio de 20 g, dos quais 10 foram utilizados para controle. Após o período de observação, a DL50 foi calculada conforme o Método de Reed e Muench.10
Como mosto, foi usada a fração solúvel obtida após a etapa hidrolítica. O mosto teve o pH corrigido para 5,0 com uso de hidróxido de cálcio hidratado. As fermentações foram realizadas em biorreator instrumentado modelo Biostatâ (B.Braun Biotech International) com volume nominal de 2,0 L. O sistema não aerado foi mantido sob agitação de 100 rpm durante 8 h a 33 °C. Como agente fermentador foi utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae a uma concentração de 10 g L-1.
Para realização das análises do processo fermentativo, foram amostradas alíquotas de 1,0 mL em intervalos de 1 h. As amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 5 min. O sobrenadante seguiu para a quantificação de açúcares e etanol. A biomassa centrifugada foi ressuspensa ao volume original com água destilada e quantificada através da leitura de absorbância em espectro-fotômetro (Spectrumlab modelo 22PC) a 570 nm com posterior correlação com curva de calibração que relaciona biomassa, em g L-1, com absorvância (y= 2,03x; R2= 0,9954).
O sobrenadante, após filtração em membrana de acetato de celulose (MillexTM 0.22 µ, Millipore) e diluição de 10 vezes com água destilada, foi analisado utilizando o equipamento de cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE) da Waters® Corporation, contendo o sistema de bombeamento modelo 510 (Waters), injetor Rheodyne, detector de índice de refração modelo 2487 (Waters) e integrador HP 3390A (Hewlett Packard). Foi utilizada a coluna de troca iônica Aminex® HPX-87P (BioRad®). Como fase móvel foi utilizada água deionizada a uma vazão de 0,6 mL min-1 sob pressão de 500 psi. As amostras foram injetadas através de loop de 5 µL. As temperaturas do forno e do detector foram de 80 e 40 °C, respectivamente. Açúcares e etanol foram quantificados com base em padrões externos.
Paralelamente, os açúcares redutores totais foram analisados pelo método do ácido dinitro-salicílico (DNSA).11 As leituras foram realizadas em espectrofotômetro com comprimento de onda de 540 nm.
A análise do teor de amido da torta de mamona foi fundamental para o estabelecimento de todas as correlações mássicas e determinação dos rendimentos de hidrólise e de fermentação. A torta de mamona apresentou um teor de amido igual a 48 ± 0,53% (m/m). Isso significa, considerando um processo hidrolítico com eficiência de 100%, que a hidrólise de 100 g de torta pode gerar 53 g de glicose. Esta quantidade de glicose, após fermentação, pode gerar até 25,3 g de etanol por 100 g de torta de mamona.
Na condição hidrolítica trabalhada, empregando ácido sulfúrico a 0,25 mol L-1, temperatura de 120 °C, tempo de hidrólise de 40 min e razão sólido: líquido de 1:6, foi obtido um hidrolisado contendo 28,5 ± 1,3 g L-1 de açúcares redutores totais. Isso significa que a eficiência do processo hidrolítico foi de 32,2% ou que foram produzidos 17,1 g de açúcares redutores por 100 g de torta. Esse valor é compatível com a concentração de açúcares redutores obtida em estudos recentes de hidrólise ácida de biomassas residuais (20,9 a 40,3 g L-1 de açúcares) e guarda relação com as variáveis concentração de ácido sulfúrico, tempo e temperatura de hidrólise.12
A análise cromatográfica do hidrolisado revelou a existência de outros açúcares além da glicose e a presença de hidroximetil-furfural (Tabela 1). Todos os açúcares identificados cromatograficamente no hidrolisado são passíveis de fermentação por S. cerevisiae e, portanto, conversíveis a etanol.13 A presença de 0,51 g L-1 de hidroximetil-furfural, um reconhecido agente inibidor do processo fermentativo, não interferiu na fermentação conduzida com Saccharomyces cerevisiae, tendo sido observada a completa conversão dos açúcares redutores após 8 h (Figura 1). A produtividade volumétrica (QP) do processo fermentativo foi igual a 1,38 g L-1 h-1, sendo atingida uma concentração de 11 g L-1 ao final do processo, o equivalente a um rendimento (YP/S) de 0,44 g g-1. O vinhoto obtido após a destilação do etanol presente no mosto fermentado, de acordo com testes de toxicidade expresso em IC50, não se mostrou tóxico.7 A partir desses resultados e da eficiência de 32,2% observada na hidrólise ácida, podemos projetar um rendimento de cerca de 102 L de etanol por tonelada de torta de mamona processada, o que corresponde a 64% do etanol demandado na etapa de transesterificação do óleo de mamona para obtenção dos ésteres etílicos.
A avaliação da dose letal em camundongos (DL50) para soluções de peptídeos alergênicos extraídos da torta de mamona e do resíduo sólido, obtido após a hidrólise, mostrou que o tratamento com H2SO4, na temperatura e tempo estabelecidos para a hidrólise do amido, foi responsável pela redução, em pelo menos 237 vezes, da letalidade da torta de mamona in natura (Tabelas 2 e 3), não resultando em morte de camundongos em período de até 96 h. A destoxificação da torta de mamona submetida à hidrólise por H2SO4 a alta temperatura pode ser atribuída à hidrólise e/ou desnaturação térmica dos peptídeos tóxicos da mamona, mormente a ricina, a ricinina e CB-1.14,15
Podemos, assim, considerar que o subproduto sólido da hidrólise ácida da torta de mamona, majoritariamente constituído por fibras e proteínas,16 apresenta potencial emprego na composição de rações.17
A torta de mamona, além de mostrar-se apta como matéria-prima para produção de etanol, sofreu um efeito colateral através do processamento hidrolítico, sob condições ácidas, que a tornou isenta de letalidade quando testada em camundongos. Esse resultado indica a possibilidade do uso do resíduo sólido obtido pós-tratamento hidrolítico como matéria-prima para o fabrico de rações. Essas informações permitem propor um modelo industrial onde estejam integrados processos de extração de óleo de mamona, esterificação etílica com o álcool produzido a partir do resíduo da extração do óleo de mamona e a destinação do resíduo sólido do processo de sacarificação química da torta de mamona para o fabrico de ração.
Ao apoio da Gerência de Biotecnologia e Tratamentos Ambientais do CENPES/Petrobras e ao Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos da Escola de Química da UFRJ por todo auxílio.
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