Pasta do Professor — Mielograma e Imunofenotipagem por Citometria de Fluxo em Hematologia - Prática e Interpretação
Autor(es): OLIVEIRA, Raimundo Antônio; PEREIRA, Juliana; BEITLER, Beatriz
Esta obra é dividida em três partes, que abordam temas como mielograma, imunofenotipagem em hematologia, neoplasias hematológicas e critérios de classificação.lém disso, os capítulos são ilustrados com esquemas, gráficos e fotos das diferentes células sanguíneas, possibilitando melhor compreensão do texto.eitura fundamental a todos que estudam e trabalham na área da hematologia.
Capítulo 1 - Introdução ao Mielograma
O mielograma (BMA, bone marrow aspirate) é o exame que avalia o parênquima do órgão formador das células do sangue, a medula óssea. Após sua punção (aspiração), a amostra de medula óssea é distendida em lâmina e é feita a análise morfológica do seu esfregaço corado.
O exame da medula óssea torna‑se indispensável para o diagnóstico e monitoramento de muitas doenças hemato‑ lógicas. Ele envolve a avaliação de dois tipos de espécimes:
•	O aspirado de medula óssea distendido em um esfre‑ gaço corado, o qual oferece excelente caracterização morfológica e contagem diferencial das várias linha‑ gens das células precursoras do sangue, denominado, rotineiramente, mielograma
•	O tecido medular ósseo (avaliação histológica), por meio da biopsia de medula óssea, mais indicada para avaliação da celularidade total da medula, da celulari‑ dade da série megacariocítica (plaquetária), do grau de fibrose medular, da aplasia de medula e das infiltrações medulares por metástases e infecções.
Capítulo 2 - Passo a Passo do Mielograma
Passo a Passo do Mielograma
Fundamentos básicos do mielograma
Como visto no Capítulo 1, mielograma é o exame que traduz o perfil das células hematopoé­ticas da medula
óssea, obtidas por punção da crista ilía­ca ou esternal, ou mesmo da tíbia (em crianças pequenas), seguida de aspi‑ ração, que são distendidas em lâminas e coradas pelos derivados de Romanowsky. Esse exame possibilita deter‑ minar a proporção e o grau de maturação das diferentes linhagens hematopoé­ticas, assim como a presença de cé‑ lulas anômalas ou de parasitas, e é composto de:
•	Avaliação da celularidade total (CT) da medula
•	Relação granulocítica/eritrocítica (G:E)
•	Determinação da celularidade relativa e absoluta e descrição morfológica qualitativa de cada série especí‑ fica (granulocítica, eritroide, linfomonoplasmocítica, megacariocítica)
•	Caracterização de células anômalas, quando presentes
•	Conclusão final do laudo.
Sangue periférico e dados clínicos
Capítulo 3 - Maturação das Células Hematológicas na Medula Óssea | Morfologia e Valor Diagnóstico
Maturação das Células
Hematológicas na Medula Óssea |
Morfologia e Valor Diagnóstico
Está definida a seguir a nomenclatura a ser utilizada neste livro para as células formadoras do sangue, pois não há uniformidade na definição de células precursoras e proge‑ nitoras na literatura. Alguns autores separam‑nas, outros denominam precursoras e progenitoras sem distinção.
Para efeito didático, serão conceituadas separadamente as células‑tronco, as células progenitoras e as células pre‑ cursoras. Em seguida, serão descritas morfologicamente todas as linhagens sanguí­neas com sua maturação normal na medula, e será abordado ainda o valor clínico e diag‑ nóstico de cada uma das células na medula e no sangue.
•	Células‑tronco: células‑mãe pluripotentes, conheci‑ das como unidades formadoras de colônias esplênicas
(CFU‑S, colony‑forming unit of spleen), pois foram des‑ cobertas por meio de experimentos em baço de camun‑ dongos. São capazes de dar origem a todas as linhagens celulares, portanto, às células progenitoras, tanto mie‑ loides como linfoides, na medula óssea do ser humano.
Capítulo 4 - Células do Estroma Medular e Células nos Processos Reacionais e Neoplásicos (Anômalas) da Medula Óssea ou do Sangue Periférico
Células do Estroma Medular e
Células nos Processos Reacionais e Neoplásicos (Anômalas) da
Medula Óssea ou do Sangue
Além das células parenquimatosas medulares (discutidas no Capítulo 3), ou seja, as células precursoras e maduras características do tecido medular (células hematológicas propriamente ditas), também podem estar presentes no mielograma, mesmo que de modo relativamente in‑ comum, as células do estroma medular (tipos celulares raros normais). Tais células não caracterizam o tecido me‑ dular ósseo, mas podem ser encontradas esporadicamente no aspirado de medula coletado para o mielograma, e não no sangue periférico. Elas podem ser classificadas como osteo­blastos, osteo­clastos, macrófagos e mastócitos.
As células hematológicas anormais encontradas no mielograma (ou no hemograma) têm como caracterís‑ ticas básicas a morfologia alterada ou serem imaturas e estarem em número acima do normal para a idade do pa‑ ciente. Podem estar associadas a processos patológicos não neoplásicos, sendo mais apropriadamente denomi‑ nadas células reacionais (secundárias), ou, quando especí‑ ficas dos processos neoplásicos ou pré‑neoplásicos hematológicos, chamadas de células anômalas.
Capítulo 5 - Interpretação Clínica do Mielograma
Interpretação Clínica do Mielograma
As anormalidades no mielograma podem decorrer do aumento quantitativo de uma determinada série ou linha­gem sobre as demais, as alterações quantitativas, ou de alterações qualitativas, causadas pela presença de cé‑ lulas de morfologia alterada, como células atípicas ou células displásicas, células anômalas (células hematológi‑ cas neoplásicas, como blastos leucêmicos ou linfócitos anômalos neoplásicos das neoplasias linfoproliferativas crônicas) e células tumorais de metástases, ou pela pre‑ sença de células do lúpus eritematoso (LE), das células da doença de Gaucher ou das de Niemann‑Pick. Parasitas
(malária, tripanossomíase, leishmaniose, toxoplasmose) também são caracterizados como anormalidade qualita‑ tiva na medula. Em boa parte das doenças, pode haver associação de alterações qualitativas e quantitativas.
Clinicamente, o mielograma reflete dois tipos de doenças: as hematológicas, nas quais a conclusão geralmente tem direto e indiscutível valor diagnóstico, e as não hematológicas, de cunho reacional ou secundário, como infecções, reações a medicamentos, intoxicações, processos alérgicos etc. Então, o mielograma nem é recomendado ou o laudo
Capítulo 6 - Leucemias Agudas | Diagnóstico e Classificações FAB, EGIL e OMS
Leucemias Agudas | Diagnóstico e Classificações FAB, EGIL e OMS
As leucemias agudas correspondem a um grupo hetero‑ gêneo de doenças que se diferem em etiologia, patogênese, prognóstico e tratamento. Elas são consequência de alte‑ rações genéticas (oncogenes) que promovem o bloqueio maturativo total ou parcial de células precursoras (blastos) mieloides, linfoides, bifenotípicas ou, até mesmo, indife‑ renciadas, que provocam aumento do número de blastos na medula óssea (MO) e no sangue periférico.
A separação das leucemias agudas em três grandes grupos, mieloides (LMA), linfoides (LLA) e bifenotípicas
(BAL), além do raro subtipo das indiferenciadas (AUL), de acordo com a linhagem do blasto afetada, reduz, de certo modo, tal heterogeneidade. Mesmo assim, há várias diferenças entre os subtipos de leucemias agudas em cada grupo. Deste modo, é imperativo classificá‑las em sub‑ tipos para uma mesma linhagem. A uniformização dos critérios de classificação das leucemias agudas em sub‑ grupos como entidades biológicas distintas facilitam o entendimento da história natural, do prognóstico e a de‑ finição de um tratamento específico, principalmente ao se levar em conta critérios genético‑moleculares associados aos imunológicos, morfológicos e clínicos.
Capítulo 7 - Síndromes Mielodisplásicas, Neoplasias Mielodisplásicas/Mieloproliferativas, Processos Reacionais Mieloides e Anomalias Hereditárias Associadas a Alterações Morfológicas nos Leucócitos
Síndromes Mielodisplásicas,
Neoplasias Mielodisplásicas/
Mieloproliferativas, Processos
Reacionais Mieloides e Anomalias
Hereditárias Associadas a Alterações Morfológicas nos Leucócitos
As síndromes mielodisplásicas (SMD) são um grupo de doenças clonais de células-tronco hematopoéticas, que resultam em produção ineficaz por defeitos de maturação
(displasia) em uma ou mais séries da linhagem mieloide
(eritroide, granulocítica e/ou megacariocítica) na medula
óssea. Caracterizam-se por citopenia(s) no sangue, medula óssea hiper ou normocelular e grandes displasias.
Há elevação da taxa de apoptose (morte celular). As displasias nas SMD podem ou não estar acompanhadas de aumento do número de mieloblastos (os quais sempre devem estar abaixo de 20%) em sangue periférico e em medula óssea, e têm maior risco de progressão para leucemias mieloides agudas (LMA).
Embora a progressão para LMA seja um decurso natural de parte dos casos de SMD, a proporção de pacientes que evoluem para LMA varia substancialmente entre os seus diversos subtipos. Por exemplo, a maior parte dos pacientes com SMD e aumento do número de blastos em sangue e medula (como nas AREB) evolui terminalmente para LMA. Por outro lado, pacientes com SMD sem blastos aumentados e com displasia em apenas uma das séries, como em AR e ARSA, apresentam
Capítulo 8 - Neoplasias Mieloproliferativas | Diagnóstico e Classificação OMS
Neoplasias Mieloproliferativas |
Diagnóstico e Classificação OMS
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), as neoplasias mieloides são divididas em quatro grandes grupos: neoplasias mieloproliferativas; síndromes mielodisplásicas; neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas e leucemias mieloides agudas. As três primeiras têm curso clínico eminentemente crônico; as leucemias mieloides agudas têm comportamento caracteristicamente agudo. Neste capítulo serão abordadas as neoplasias mieloproliferativas, incluindo casos clínicos comentados com mielograma. No Capítulo 6 são vistas as leucemias agudas e, no Capítulo 7, as síndromes mielodisplásicas, neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas, processos reacionais (benignos) mieloides e as principais síndromes associadas a alterações morfológicas nos leucócitos.
As neoplasias mieloproliferativas (NMP) são doenças clonais das células-tronco pluripotentes caracterizadas por hematopoese medular efetiva, manutenção da capacidade maturativa, sem evidência de displasia, que resultam em medula hipercelular (exceto em mielofibrose), elevadas contagens de uma ou mais linhagens celulares mieloides no sangue, e que cursam em geral com hepatoesplenomegalia. A classificação OMS de 2008 inclui, dentre as neoplasias mieloproliferativas, a leucemia mieloide crônica
Capítulo 9 - Neoplasias Linfoproliferativas Crônicas | Diagnóstico
Crônicas | Diagnóstico
As neoplasias linfoproliferativas crônicas (NLPC) carac‑ terizam‑se por proliferação maligna de células linfoides de origem B, de origem T ou natural killer (NK) imunolo‑ gicamente maduras. Cerca de 85% das NLPC se originam de células linfoides B, 10% de células linfoides T e 5% de células NK. Anteriormente à classificação da Organização
Mundial da Saúde (OMS) de 2008, as NLPC eram deno‑ minadas doenças linfoproliferativas crônicas (DLPC).
As NLPC incluem as neoplasias linfoides crônicas leucêmicas e os linfomas não Hodgkin (LNH). Quando têm origem primária na medula óssea e no sangue pe‑ riférico, são designadas neoplasias linfoproliferativas primariamente leucêmicas (leucemias); quando se ori‑ ginam nos órgãos linfoides secundários (linfonodos, baço, tecidos linfoides das mucosas), são chamadas de linfomas. Quando as células dos linfomas infiltram o sangue periférico ou a medula óssea, são designados lin‑ fomas em fase circulante ou em fase leucêmica (são os
Capítulo 10 - Citoquímica Automatizada da Peroxidase na Triagem para Diagnóstico das Doenças Hematológicas
Citoquímica Automatizada da Peroxidase na Triagem para Diagnóstico das Doenças
Neste capítulo será discutida a utilização da prova cito‑ química da peroxidase, consagrada nas colorações de esfregaços de sangue e medula óssea para diagnóstico di‑ ferencial das leucemias agudas (classificação morfológica das leucemias – FAB, 1976). Esta coloração citoquímica
é a base para a contagem diferencial de leucócitos nos contadores hematológicos da antiga Technicom® (mo‑ delos de contadores H1 e H2), que foi incorporada pela
Bayer® (modelo H3), hoje representada pelos Advia‑120,
Advia‑2120 e Advia-2120i da Siemens®. Estes modelos de aparelhos perfazem a contagem diferencial de leucócitos utilizando a atividade citoplasmática para peroxidase versus o tamanho da célula, por meio de um citograma
(scatter plot). Nesse canal de contagem os leucócitos são divididos em cinco grupos de células (Figuras 10.1 e 10.2):
Capítulo 11 - Conceitos Básicos de Citometria de Fluxo e Imunofenotipagem
Conceitos Básicos de Citometria de Fluxo e Imunofenotipagem
O citômetro de fluxo é um equipamento capaz de mensurar simultaneamente múltiplos parâmetros de uma população de células ou de partículas em suspensão, detectadas uma a uma quando, ao passarem por uma pequena abertura em um fluxo contínuo, um feixe de luz laser incide sobre elas. Esses parâmetros incluem propriedades físicas, tais como tamanho e complexidade (granularidade) citoplasmática de uma célula, seus antígenos
(marcadores) de membrana, citoplasma ou núcleo, e seu conteúdo de DNA-RNA.
A citometria de fluxo é uma poderosa e versátil tecnologia que identifica parâmetros de células ou partículas em suspensão. É amplamente aplicada na identificação dos antígenos celulares por meio de anticorpos específicos ligados a fluorocromos, os anticorpos monoclonais marcados, que reconhecem com extrema especificidade o seu antígeno celular. Esse processo de caracterização das células com base em seus antígenos é denominado imunofenotipagem.
Capítulo 12 - Fundamentos para Análise Imunofenotípica por Citometria de Fluxo das Células no Sangue Periférico e na Medula Óssea
Imunofenotípica por Citometria de Fluxo das Células no Sangue
Periférico e na Medula Óssea
Após o procedimento de bancada, com a escolha e mar‑ cação dos anticorpos e aquisição das células no citômetro, deve‑se proceder à análise de dados. Para isso, é indispen‑ sável o conhecimento das características morfológicas das células do sangue e da medula óssea (ver Capítulo 3), das suas características físicas no citômetro, em forward scatter
(FSC), que representa o tamanho, e em side scatter (SSC), que representa a granularidade ou complexidade interna, e dos seus caracteres em relação aos seus antígenos, de acordo com a linhagem e fase maturativa. Neste capítulo será des‑ tacada a hematopoese com base nos antígenos celulares e serão mostrados exemplos práticos para o reconhecimento das células em amostras de sangue e de medula normais e patológicas, como fundamento básico para a análise de casos de imunofenotipagem por citometria de fluxo.
Capítulo 13 - Imunofenotipagem em Leucemias Agudas | Fundamentos e Casos Clínicos
Imunofenotipagem em Leucemias Agudas |
Fundamentos e Casos Clínicos
As leucemias agudas são entidades caracterizadas pelo aumento do número de blastos (células precursoras ne‑ oplásicas) na medula óssea ou no sangue periférico. De acordo com a classificação da Organização Mundial da
Saúde (OMS) (Jafe et al., 2001; Swerdlow et al., 2008), as leucemias agudas são definidas quando o número de blastos na medula óssea é maior que 20% do total de cé‑ lulas nucleadas (TCN). Esse aumento de blastos na me‑ dula decorre de um bloqueio maturativo total ou parcial de células progenitoras ou precursoras.
As leucemias agudas e os linfomas linfoblásticos podem ser caracterizados por blastos (células anômalas) na medula óssea, no sangue periférico ou nos demais fluidos orgânicos. Essas doenças podem apresentar desde citopenias até leucocitoses no sangue, relacionadas à ocu‑ pação medular e infiltração em outros locais extramedu‑ lares. Portanto, o sangue pode conter maior, normal ou reduzido número de leucócitos, geralmente associado
Capítulo 14 - Análise de Casos de Imunofenotipagem em Neoplasias Mieloproliferativas, Síndromes Mielodisplásicas e Neoplasias Mielodisplásicas/Mieloproliferativas Crônicas
Análise de Casos de
Imunofenotipagem em
Síndromes Mielodisplásicas e
Mieloproliferativas Crônicas
Como o Capítulo 13 foi dedicado às leucemias agudas, este capítulo tratará da imunofenotipagem das neoplasias mieloproliferativas (NMP), das síndromes mielodisplá‑ sicas (SMD) e das neoplasias mielodisplásicas/mielopro‑ liferativas (SMD/NMP) por citometria de fluxo, com base em casos clínicos.
Para este grupo de doenças, no qual frequentemente
é encontrada grande variedade de células com carac‑ terísticas fenotípicas distintas ou mesmo aberrantes, a estratégia para escolha dos monoclonais pode variar caso a caso, mas geralmente se usa o CD45 em todos os tubos. A análise do CD45 (eixo X) × SSC, side scatter,
(eixo Y) é indispensável para avaliar displasias em gra‑ nulócitos, uma vez que em grande parte dos portadores de SMD ou de SMD/NMP há hipogranulação da série granulocítica, detectável pela caracterização da baixa
Capítulo 15 - Imunofenotipagem em Neoplasias Linfoproliferativas Crônicas | Análise de Casos
Crônicas | Análise de Casos
Como no Capítulo 13, dedicado às leucemias agudas, este capítulo trata da imunofenotipagem de neoplasias linfoproliferativas crônicas (NLPC) (leucemias linfoides crônicas primárias e linfomas não Hodgkin em fase leucê‑ mica) por citometria de fluxo, com base em casos clínicos.
Como para este grupo de doenças as células anômalas a serem determinadas são, invariavelmente, linfócitos maduros neoplásicos, a delimitação da população a ser avaliada (a delimitação do gate de estudo) deve ser feita, com raras exceções, no local a ser ocupado pelos linfó‑ citos, portanto, geralmente em região de pequeno a médio porte em forward scatter (FSC) e de baixa complexidade interna em side scatter (SSC).
Quando a quantidade de células linfoides maduras anômalas for elevada e praticamente única, como, por exemplo, em grande parte dos portadores de leuce‑ mias prolinfocíticas (LPL), com percentual quase total
Apêndice - Técnicas para Colorações Hematológicas e Imunofenotipagem
Técnicas para Colorações
Hematológicas e
Este apêndice descreve as técnicas utilizadas nas práticas das colorações hematológicas e imunofenotipagem por citometria de fluxo.
Preparo dos esfregaços de sangue periférico e do aspirado de medula
óssea*
•	Pipetar 5 ml de sangue periférico recém‑colhido em lâmina comum de hemograma
•	Colocar o sangue próximo ao início da lâmina (Fi‑ gura 1)
•	Com o auxílio de uma lâmina extensora (com bordas menores que a lâmina comum), distender com um ân‑ gulo de 15°, em movimento uniforme e não muito rá‑ pido, o sangue recém‑colocado sobre a lâmina comum no sentido do local da gota de sangue para o final da lâmina (Figura 2).
Observações importantes para um bom esfregaço
•	Essa quantidade de sangue (5 ml) e a utilização do ân‑ gulo de 15° evitam que o esfregaço se prolongue até o final da lâmina. Um bom esfregaço deve terminar ao final de 2/3 da lâmina. O aumento da velocidade faz com que os esfregaços se tornem muito curtos e com mínima região de leitura. A não espera para o total espalhamento do sangue na base da lâmina extensora faz com que os esfregaços fiquem em arco, com pou‑ ca região de leitura e impossibilidade de ter densidade homogênea do esfregaço e dificuldade na contagem celular (Figuras 3 a 6)