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Apresentação em tema: "Métodos Microbiológicos Rápidos"— Transcrição da apresentação:
1 Métodos Microbiológicos Rápidos
Encontro ABRASP 2011 Métodos Microbiológicos Rápidos Adriana Bugno Instituto Adolfo Lutz
2 Métodos microbiológicos
A história da Microbiologia é uma estória de pessoas comuns e indivíduos peculiares, de zeladores, donas de casa, químicos, médicos, botânicos em buscas de descobertas. Não eram mentes investigativas conscientemente em busca de desenvolver novos métodos para um novo campo da ciência Exploradores guiados pelo acaso ou pela curiosidade por problemas do dia-a-dia, para os quais não se tinham respostas por imensa compaixão pelo sofrimento humano
3 Métodos microbiológicos
Porém, não foi o sofrimento humano que inicialmente motivou os investigadores, mas os estudos básicos e aplicados dos processos industriais, os quais abriram caminho para as aplicações médicas É uma história de eventos e fenômenos para os quais não se tinham explicação, seguidos de observações para as quais não se tinham aplicações óbvias, de eventual associação de causa e efeito, tudo em um vasto campo de investigação.
4 As Eras da Microbiologia
Alguns pesquisadores dividem a história da Microbiologia em Eras: Século 20 Século 21 Século 17 Século 18 Século 19 5000 a.C. Era da Especulação Era da Observação Era do Cultivo Era de Estudos Fisiológicos e Moleculares Era dos MMR
5 Eventos e fenômenos para os quais não se tinham explicação ocorriam
Era da Especulação Os micro-organismos interagem com o homem e seu ambiente desde o início da humanidade, de forma positiva ou negativa. Eventos e fenômenos para os quais não se tinham explicação ocorriam Se não adicionar porções de pão ou bebida fermentada no próximo lote de produção, o pão não crescia e as uvas não fermentavam. 542 d.C.: epidemia atingiu Constantinopla e se espalhou pela Europa e Ásia. Século 14: a mais famosa das epidemias, a Peste Negra, causou a morte de 30-50% da população da Europa e de ~ 40 milhões no mundo. Século 15: a Europa foi atingida por uma epidemia de sífilis. Século 16: epidemia de sarampo causou a morte de 100 milhões de pessoas no mundo. Pessoas ficavam doentes sem que houvesse qualquer pista sobre a natureza ou a causa de seus males  castigo dos deuses
6 Esta foi a era dos avanços no campo da microscopia
Era da Observação A humanidade compreendeu que um mundo desconhecido e invisível estava ao seu redor. A partir do século 17, tem início a busca por enxergar este mundo e aprender a lidar com ele. Esta foi a era dos avanços no campo da microscopia Em meados do século 17, Anton van Leeuwenhoek preparou lentes muito melhores que as de seu tempo, sem qualquer intenção de encontrar fontes de vida, mas somente movido pela curiosidade de poder ver pequenas coisas: insetos, tecidos, poeiras. Até que, por algum motivo, resolveu ver a água da chuva e encontrou "pequenas criaturas" Lazzaro Spallanzani – conceito de autoclavação, anaerobiose Giovanni Battista Amici – lentes objetivas acromáticas Carl Zeiss Ernst Abbe – lentes de imersão em óleo
7 Era do cultivo Com algumas ferramentas básicas e alguns conceitos, a microbiologia emergiu do período da simples observação. Apesar das descobertas feitas até então, a causa das doenças infecciosas continuava sendo totalmente desconhecida. Louis Pasteur: em 1857, interessa-se por desvendar as razões dos processos de fermentação que transformavam açúcar de beterraba em álcool, mas algumas vezes em ácido. Somente após compreender o papel dos micro-organismos no processo de fermentação, sua atenção se volta ao estudo das doenças infecciosas. Joseph Lister: iniciou as práticas de antissepsia para prevenir a contaminação microbiana durante cirurgias e partos. Robert Koch: "detetive de micróbios" durante uma epidemia de cólera. Em 1873 começou os estudos com anthrax e deduziu que os micro-organismos eram a causa da morte de animais. Também fez as primeiras fotomicrografias de bactérias
8 Era do cultivo Com algumas ferramentas básicas e alguns conceitos, a microbiologia emergiu do período da simples observação. Desenvolvimento das técnicas de coloração: Ferdinand Cohn: coloração de cortes histológicos com corantes vegetais Robert Koch: técnica de fixação de bactérias e coloração com azul de metileno Erlich: técnica de diferenciação de bacilos da tuberculose por coloração Gram: técnica de diferenciação de bactérias Avanços em imunologia, com a descoberta e produção de vacinas Início dos estudos sobre insetos vetores e do desenvolvimento da quimioterapia
9 Era dos estudos fisiológicos e moleculares
O século 20 testemunhou grandes avanços: metabolismo microbiano, genética microbiana, biologia molecular, terapia antimicrobiana, desenvolvimento de meios de cultura seletivos e diferenciais, virologia, ... Além dos conhecimentos básicos de bioquímica microbiana, os estudos do metabolismo microbiano tornaram possíveis o desenvolvimento de muitos métodos diagnósticos para selecionar ou diferenciar micro-organismos; A taxonomia microbiana deixou de ser baseada puramente em características morfológicas e passou a considerar as características metabólicas; Reclassificação de espécies e gêneros resultou do estudos de biologia molecular; O papel e a natureza do DNA nasceu de estudos para compreender a variação microbiana e a resistência a antibióticos - Em 1983, o DNA transformou-se em ferramenta quando Karry Mullis desenvolveu a técnica de PCR, que tornou possível a amplificação de DNA
10 Métodos microbiológicos
Todo conhecimento adquirido é o fundamento dos métodos analíticos utilizados até hoje Os métodos microbiológicos clássicos ou de referência são: Amplamente acessíveis; Harmonizados; Aceitos por agências regulatórias; Demandam	grande quantidade de materiais alta capacitação técnica tempo longo tanto na execução analítica como para obtenção dos resultados Custos relativamente altos Exigem crescimento microbiano da ordem de 106 células para ser macroscopicamente visível E....
11 Métodos microbiológicos
Ofereceu a base para o desenvolvimento de novas aplicações da ciência e de tecnologias inovadoras com potenciais vantagens sobre os métodos clássicos Os métodos microbiológicos rápidos são desenvolvidos para: Obter resultados analíticos confiáveis que assegurem de forma mais eficaz a segurança do produto Reduzir o tempo de detecção Melhorar o isolamento, enumeração e caracterização de micro-organismos, além de melhorar o fluxo para análise de múltiplas amostras Possibilitar automação, miniaturização e de intervenção durante o processo de fabricação – real time
12 Micro-organismos viáveis endotoxinas bacterianas
Produtos estéreis O controle de produtos estéreis visa assegurar a ausência de Micro-organismos viáveis Teste de Esterilidade Toxinas microbianas Substância pirogênica Pirogênio Endotoxina bacteriana Teste de Pirogênio Determinação de endotoxinas bacterianas
13 Método clássico, oficializado em 1942 na USP XII
Teste do Pirogênio Método clássico, oficializado em 1942 na USP XII Método in vivo Alto custo	Manutenção de biotério Alta capacitação técnica	Analistas capacitados na técnica analítica Habilidade para o manuseio de animais Demanda tempo excessivo	Preparação do teste Obtenção de resultados (3 horas) Ensaio limite
14 Endotoxinas bacterianas
O teste do LAL é o primeiro MMR implantado na indústria farmacêutica para avaliação de produtos estéreis (1974) Método in vitro Menor custo Menor capacitação técnica dos analistas Demanda menor tempo para a preparação do teste e para obtenção de resultados (1 hora) Maior eficiência, especificidade, sensibilidade, exatidão Ensaios: qualitativos (formação de gel) e quantitativos (cinético)
15 Portable Test System Nova tecnologia para quantificação de endotoxinas bacterianas, baseada no teste cinético do LAL Maior facilidade analítica Menor tempo para a preparação do teste e para obtenção de resultados (15 minutos) Possibilidade de monitoramento durante processo produtivo Fonte:
16 Teste de Esterilidade Verificar a presença de micro-organismos viáveis em produtos que tenham sido submetidos a algum processo esterilizante, pela inoculação em meio de cultura nutriente, que permite a detecção de bactérias, bolores e leveduras, incubado por temperatura e tempos adequados Oficializado: em 1932 na British Pharmacopeia e em 1936 USP XI
17 Teste de Esterilidade 1936 Inoculação direta 1938 1940 1942 1944 1946
1948 1950 1960 1970 1980 indireta Indireta em sistema fechado Fonte:
18 Teste de Esterilidade 1936 Inoculação direta 1938 1940 1942 1944 1946 1948 1950 1960 1970 1980 indireta Indireta em sistema fechado Caldo peptonado + gelatina + solução de Litmus Meio Tioglicolato Caldo peptonado + mel Sabouraud Caseína de soja
19 Teste de Esterilidade 1936 1938 1940 1942 1944 1946 1948 1950 1960 1970 1980 Inoculação direta Inoculação indireta Caldo peptonado Caldo peptonado + gelatina + solução de Litmus Meio Tioglicolato Inoculação Indireta em sistema fechado Caldo peptonado + mel Caldo Sabouraud Caldo Caseína de soja 5 dias 10 dias 14 dias 07 dias 14 dias A partir de 2000, 14 dias
20 Limitações do Teste de esterilidade
Quanto aos aspectos analíticos, observa-se uma evolução na metodologia do Teste de Esterilidade, porém persistem algumas limitações no que diz respeito à segurança de informações A falta de certeza absoluta quanto a esterilidade de todas as unidades do lote, considerando que a análise é realizada em uma amostra representativa (limitação estatística) Escopo limitado à detecção de bactérias e fungos	– não adequado à detecção de vírus, micobactérias, micoplasmas, micro-organismos psicrófilos ou termófilos Além disso: Demandam	quantidades expressivas de material e equipamentos tempo longo para detecção (visual) do crescimento microbiano capacitação técnica
21 Métodos microbiológicos rápidos aplicáveis ao Teste de esterilidade
Correspondem:	à automação de métodos existentes ou estão baseados em tecnologias novas Objetivo de oferecer melhorias significativas em termos de rapidez, exatidão, precisão e especificidade Crescimento microbiano Viabilidade microbiana
22 RMM baseado no crescimento microbiano
Medida de parâmetros bioquímicos ou fisiológicos que refletem o crescimento microbiano Bioluminescência do ATP Fonte: Detecção colorimétrica da produção de CO2 Fonte:
23 Bioluminescência do ATP
Fonte: Bioluminescência do ATP ATP é um conhecido marcador de viabilidade celular e o potencial de seu uso para detecção de bactérias foi inicialmente descrito por Levin e Chapelle, em 1968 O processo depende de reação enzimática aeróbica entre luciferina, luciferase e ATP, que emite luz, entre outros produtos, a qual é medida por um luminômetro ou por câmara com dispositivo de carga acoplada.
24 Detecção colorimétrica do CO2
Fonte: Detecção colorimétrica do CO2 Detecção do CO2 produzido pelo metabolismo ativo dos micro-organismos Frascos de cultura contém um sensor colorimétrico de CO2, recoberto por uma membrana permeável apenas ao CO2 CO2 gerado atravessa a membrana e atinge o sensor, que saturado com solução sensível ao pH, tem a cor alterada de verde para amarelo a medida que o nível de CO2 aumenta. Os detectores produzem sinal proporcional à intensidade de cor e à concentração de CO2 e os transdutores eletrônicos mudem as mudanças de pressão positivas ou negativas provocadas pela produção ou consumo do gás durante o crescimento microbiano Fonte:
25 RMM baseado na viabilidade celular
Detecção microbiana através do uso de marcadores de viabilidade (substrato de viabilidade) Citometria de fase sólida Fonte: Independe da proliferação microbiana Baseia-se no uso de corantes vitais dos componentes bioquímicos de células microbianas viáveis A amostra é escaneada por um detector laser e o número de células marcadas (fluorescentes) é obtido
26 Métodos microbiológicos rápidos na indústria farmacêutica
Entre as vantagens dos MMRs podemos citar: Confiabilidade e especificidade Rapidez e agilidade na liberação de resultados Diminuição do número de etapas de trabalho Diminuição do erro analítico Melhoria da qualidade dos processos Redução de custos A área clínica e a indústria de alimentos estão a frente na aplicação de MMR em relação à indústria farmacêutica, provavelmente por uma regulamentação mais restritiva que exige demonstrar a equivalência aos métodos de referência e o atendimento dos parâmetros de validação analítica
27 Parâmetros de validação
Validação de MMR Pode ser realizada segundo procedimentos descritos na USP (Capítulo <1223>) e demais compêndios farmacopeicos ou no documento PDA Technical Report 33 Parâmetros de validação Teste Qualitativo Teste Quantitativo Exatidão Não Sim Precisão Especificidade Limite de detecção Limite de quantificação Linearidade Faixa Repetibilidade Robustez Equivalência
28 Validação de MMR para Teste de Esterilidade Micro-organismos teste
PDA Technical Report 33, 2010 Micro-organismos teste Gram + Gram – Levedura Fungo filamentoso Anaeróbio Esporulado Nível de contaminação 20 UFC/mL 2 UFC/mL 0,2 UFC/mL 0,02 UFC/mL Replicatas 50 a 100 testes pelo método convencional método alternativo
29 Validação de MMR aplicado ao Teste de Esterilidade
Nível de inóculo Proporção esperada de N resultados positivos em N=100 negativos positivos 20 < 0,001 >0,999 100 2 0,135 0,865 87 0,2 0,819 0,181 18 0,02 0,980 0,020 Avaliação estatística Os métodos são equivalentes quando a proporção de resultados positivos e negativos obtidos em cada um deles não apresenta diferença estatisticamente significativa
30 Dificuldades na implantação de MMR
Apesar das vantagens, devem ser consideradas algumas dificuldades na utilização de MMR: Custo inicial de aquisição das tecnologias Disponibilidade limitada de alguns insumos específicos Necessidade de revisão dos critérios regulatórios por agências como FDA, ANVISA Treinamento Necessidade de recursos suficientes e expertise tecnológica para realização dos estudos de validação e equivalência
31 Considerações finais A utilização de MMR corresponde a novas oportunidades na garantia da qualidade e segurança de uso de produtos farmacêuticos Uma variedade de novas possibilidades estão sendo disponibilizadas, com vantagens e dificuldades que devem ser consideradas na escolha da tecnologia mais adequada à finalidade pretendida..... ..... facilidades, praticidade, rapidez.... ..... Porém nenhuma tecnologia será tão perfeita que irá prescindir da avaliação dos dados por um microbiologista!