PCR ÇEŞİTLERİ
KLASİK PCR:
Hedef DNA dizisinin her iki ucuna özgü spesifik primerler kullanılarak termostabil DNA polimeraz yardımıyla uygulanan PCR çeşididir.Daha sonraki analizler için döngü sayısına göre üstel oranda artan düzeyde ürün elde edilir.Tipik bir PCR üç temel basamakta gerçekleşir:
*Denatürasyon: İlk aşamada DNA molekülünün çift zincirli yapısı yüksek ısı yardımıyla birbirinden ayrılır(denatürasyon) .Çoğunlukla 94°C- 97°C arasında 15-60 sn süresince uygulanır.(İlk denatürasyon tek saykıl olarak 15 dakikaya kadar uygulanır)
Annealing(Bağlanma): Denatürasyonu takiben daha düşük ısılarda oligonükleotid primerler, ayrılmış olan tek zincirli DNA üzerinde kendi eşlenikleri olan bölgelere bağlanırlar.Bu olay çoğunlukla 47°C- 60°C arasında 30-60 sn de gerçekleşir.(G/C oranı yüksek olan bölgelerde bağlanma ısısı 68°Cye kadar arttırılabilir)
*Elongasyon(uzama): Son aşamada ısı 72°Cye kadar arttırılarak DNA polimeraz enziminin tamamlayıcı DNA zincirini uzatması sağlanır.Elongasyon basamağının süresi kullanılan polimerazın cinsine ve amplifiye edilecek DNAnın uzunluğuna göre 30sn ile 3 dakika arasında değişir.
Termal sayklırın bu üç basamağı her tekrarında DNA miktarı teorik olarak iki katına çıkar.Oluşan ürün; ilk koyulan DNA miktarı ve döngü sayısına bağlıdır. 25-40 döngü uygulanır.
Klasik PCR normalde sayısal (quantitatif) bir değerlendirme ölçüsü değildir fakat quantitatife dönüştürülür. Jel elektroforez de ürünler karşılaştırılarak veya most probable number (MPN) yardımıyla sonuca ulaşılır. MNP yönteminde ardarda seyreltmeler ve MNP hesaplayıcısı kullanılır. Tercih edilmeyen bir yöntemdir. Bir diğer yöntem de competitive (karşılaştırmalı) PCRdir. Karşılaştırmada delesyon veya insersiyon taşıyan örneklerle (farklı uzunlukta bant oluştururlar) elde edilen ürün jel elektroforezde karşılaştırılır.