Amino Asitler – Biyokimya ve Moleküler Biyolojide Laboratuvar Teknikleri – Laboratuvar Ödevleri – Lab Ödevleri – Kimya Mühendisliği – Kimya Ödev Yaptırma Ücretleri
Boyut Dışlama Kromatografisi
Şu anda, SEC kullanılarak 10 kDa’dan küçük peptitlerin ve proteinlerin çözünürlüğü yeterli değildir ve bu nedenle bu kromatografi modu, esas olarak peptitlerin büyük moleküler ağırlıklı materyalden, örn. triptik fragmanların hazırlanması sırasında veya ham fraksiyonlar için. Başka bir uygulama, kimyasal modifikasyondan sonra peptitlerin geri kazanılmasıdır, örn. alkilasyondan sonra alkilleyici ajanı çıkarmak için. Dar bir standart aralığında bile doğru moleküler ağırlık tayini, güçlü denatüranların varlığında gerçekleştirilmediği sürece güvenilir değildir.
Normal Faz Kromatografisi
Normal faz kromatografisi, proteinlerin yüksek organik çözücü konsantrasyonlarındaki zayıf çözünürlüğü ve sulu çözücülerdeki çoğu amino asidin çözünürlüğü nedeniyle, peptitlerin ayrılması için proteinler veya amino asitlerden daha yaygın olarak kullanılmıştır (a hariç hidrofobik amino asitlerin birkaçı).
Tersine, birçok peptit organik fazlarda sulu fazlardan daha fazla çözünür ve pek çok ince etkileşim bu yöntemle belirlenebilir. Aşağıda, sadece tek bir glisin kalıntısı konumunda farklılık gösteren bir dizi peptidin elüsyonu görülebilir. Glisin kalıntısının etkileşimi, zincirdeki konumuna göre değişir ve tutulmayı etkiler.
Proteinlerin ve peptitlerin sentezi veya dizilimi sırasında karşılaşılan yaygın bir problem, sulu koşullarda çözünmeyen bir ara ürünün üretilmesidir; bu, sulu dimetil-sülfoksit içinde fazla çözündürmek ve daha sonra normal faz kromatografisini kullanmak olabilir.
Amino asitler Nelerdir
Amino asitlerin sınıflandırılması
Amino asit Nedir
Bazik aminoasitler
Modifiye amino asitler
22. çeşit amino asit
Amino asit yapısı
Temel amino asitler nelerdir
Amino Asitler
Amino asit analizi için yüksek performanslı sabit fazların geliştirilmesi, ilk amino asit analizörünün piyasaya sürülmesinden bu yana şiddetle takip edilmektedir. Çoğu amino asidin düşük UV yok olma katsayısı, mevcut saptama yöntemlerinin, renkli veya floresan bir türev elde etmek için amino asidin birincil amino grubunun reaksiyonuna bağlı olduğu anlamına gelir. En yaygın terminolojileri ile anılan en popüler reaktifler de şunlardır:
- Ninhidrin
- Ortoftalaldehit (OPA) Floresamin (Fluram)
- Fenil izotiyosiyanat
- Dansil klorür
Diğer reaktifler mevcuttur ancak henüz yaygın bir kabul görmemiştir. Örneğin, yaygın olarak peptit sentezinde bloke edici bir ajan olarak kullanılan florenilmetil kloroformat, femtomol aralığında (Varian) hassasiyetle kolon öncesi etiketlemede kullanılabilir.
İyon değiştirici kromatografi
Ticari olarak temin edilebilen amino asit analizörlerinin çoğu, amino asitlerin deteksiyon reaktifi olarak ninhidrin ile ayrılması için bir iyon değişim reçinesi kullanır, ancak OPA ve fluram da kullanılabilir. Son gelişmelere rağmen, bu tür özel bir cihaz, örnek işleme kolaylığı ve tekrarlanabilirlik nedenlerinden ötürü rutin analizde sıklıkla tercih edilmektedir.
Ters faz kromatografisi
RPC’nin artan popülaritesi, birçok araştırmacıyı ve ticari laboratuvarı geleneksel HPLC ekipmanı kullanılarak gerçekleştirilebilecek ayırmalar geliştirmeye sevk etmiştir.
Bununla birlikte, RPC kullanılarak bildirilen ayırmalar, geleneksel analizörün tüm yeteneklerini kapsamaz (özellikle fizyolojik sıvılar analiz edilirken), ancak RPC’ye olan yoğun ilgi göz önüne alındığında, eşdeğer ayırmaların elde edilmesi yalnızca bir zaman meselesi olabilir. . Ters fazlı sistemlerle birlikte kullanılmak üzere özel olarak birçok tespit prosedürü geliştirilmiştir ve bunlar aşağıda tartışılmaktadır.
Ön Sütun Türevlendirme
Ortoptalaldehit (OPA). OPA’nın amino asitlerle reaksiyonunun kimyasının basitliği, bu reaktifin yaygın kullanımına yol açmış ve bazı mükemmel ayrımlar da bildirilmiştir.
OPA-amino asitlerin ayrılma süreleri, kolon uzunluğunun azaltılması ve akış oranının artırılmasıyla önemli ölçüde azaltılmıştır ve hatta aynı destek ile paketlenmiş bir koruma kolonuyla tek başına daha hızlı analiz elde edilebilir. Artık, numuneleri kromatografiden önce türetmek için bir otomatik numune alma cihazı kullanarak bu prosedürü otomatikleştirmek de mümkündür.
OPA türevlerinin dezavantajları arasında fluram ve dansil türevlerine kıyasla nispeten kısa yarı ömürleri ve ikincil aminlere karşı zayıf reaktivite (hipoklorit eklenmesi bu ikinci sorunu ortadan kaldırabilir) içerir.
Sütun sonrası türevlendirme
Ortoptalaldehit (OPA). OPA ile kolon sonrası türetme elde etmek için, florojenik reaktifle karıştırma noktasından sonra genellikle bir reaksiyon bobini (4 mm X 0.3 mm I.D.) sıralı olarak yerleştirilir. Bobinin ölü hacmi bant genişleme etkilerine katkıda bulunduğundan, çözüm ön kolon sistemi kadar iyi değildir.
Belirli kalıntıları çözmek için daha yavaş akış hızları gerekir, bu da analiz süresini uzatır. Bununla birlikte, OPA türevlendirmesinin (geleneksel analizörlerde de kullanılan) ana avantajları, tekrarlanabilirlik ve ninhidrinden farklı olarak reaksiyon için bir ısıtma cihazına da gerek olmamasıdır.
Floresamin (Fluram). Fluorescamine, amino gruplarını tespit etmek için bir reaktif olarak ninhidrin kimyası çalışmasından geliştirildi ve bir çevrimiçi kolon sonrası tespit sistemi kullanılarak proteinlerin ve peptitlerin ters fazlı kromatografik analizinde de başarıyla kullanıldı.
Bu reaktif, mobil faz tamponunun ve reaktifin iletimi için iki ayrı pompa gerektirir ve bu nedenle bu yöntemin OPA kullanmaktan daha az kolay olduğu düşünülebilir. Duyarlılık seviyesi her iki reaktif için benzerdir ve ninhidrinden 10 kat daha iyidir.
Fluram ayrıca ikincil aminlerle (örn. Prolin) zayıf bir şekilde reaksiyona girer, ancak bu, süksinik anhidrit ilavesiyle aşılabilir. İyon değiştirme kromatografisinin kullanıldığı bir ayırmayı da gösterir.
Fenilizotiyosiyanat (PITC). Protein dizilemesi için amino asitlerin tiyohidantoin (PTH) türevlerini oluşturmak için PITC’nin (Edman Reaktifi) kullanımı iyi bilinmektedir. Bu PTH türevlerinin ayrılması için ters fazlı sistemlerin geliştirilmesi, hem izokratik hem de gradyanlı elüsyon sistemlerinin tanıtılmasıyla da sonuçlanmıştır.
PTH-amino asit analizi için bir mikro delikli HPLC ünitesi, yakın zamanda piyasaya sürülen gaz fazı sıralayıcısı (Applied Biosystems) ile birlikte de artık mevcuttur.
Son zamanlarda, daha az kararlı feniltiyokarbamil (PTC) türevlerinin ayrılması için bir sistem yayınlandı ve artık yalnızca analiz hızını büyük ölçüde arttırmakla kalmayıp aynı zamanda düşük pikomol aralığına tespit hassasiyetini de artıran ticari bir kit mevcuttur. Sistem yeniden üretilebilir ancak kalifiye bir operatör gerektirir.