This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
1Department of Urology and Helen Diller Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, 2Alnylam Pharmaceuticals, Inc.
This article is a part ofJoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.Recommend JoVE to Your Librarian
Current Access Through Your IP Address
Current Access Through Your Registered Email Address
Kang, M. R., Yang, G., Charisse, K., Epstein-Barash, H., Manoharan, M., Li, L. C. An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment. J. Vis. Exp. (65), e4207, doi:10.3791/4207 (2012).
Biz, ortotopik xenograft fare mesane tümörü modelinde, intravesikal teslim küçük bir aktive edici RNA (Sarna) ile mesane kanseri tedavisi için yeni bir yöntem sunmaktadır. Fare modeli inhale genel anestezi altında üretral kateterizasyon tarafından kurulmuştur. Kimyasal yanık sonra mesane glikozaminoglikan tabakası bozmaya intravezikal gümüş nitrat çözeltisi kullanılarak mesane mukozasına tanıttı ve hücrelere eklemenizi sağlar edilir. Steril su, mesane kanseri, insan KU-7-luc2-GFP hücreleri ile çok yıkamadan sonra 2 saat süreyle durmak kesesi içine kateter ile aşılanan edilir. Mesane tümörlerinin daha sonraki büyüme vivo mesane ultrasonu ve bioluminescent görüntülemede tarafından onaylandıktan ve izlenir. Tümörler daha sonra Sarna lipid nano partiküller (LNPs) formüle ile intravezikal tedavi edilir. Tümör büyüme ultrason ve biyolüminesans ile izlenir. Bu prosedür her adım, ekli video gösterilmiştir.
Hayvan denekleri Usul Kaliforniya, San Francisco Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Hücre Hazırlık
2. Ortotopik Mesane Tümör Modeli
3. Ultrason
4. Bioluminescent Görüntüleme
5.. Sarna Hazırlık
6. Formüle Sarna intravezikal İdaresi
7. Temsilcisi Sonuçlar
KU-7-luc2-GFP hücrelerinden kaynaklanan mesane tümörleri lusiferaz bioluminescent görüntüleme (Şekil 1A ve C) ve mesane ultrasonu (Şekil 1B ve D) ile izlenebilir. Tümörler Hücre inokülasyonundan sonra 3-5 gün içinde sık sık saptanabilir. Biz farelerin% 90'ında başarılı mesane tümörü implantasyon bulundu. Intravezikal dsRNA ile muamele ensues olarak, tümör ilerlemesi Wi izlenebilirbu yöntemlerin th. Hayvan kurban sonra, tümör büyümesi, aynı zamanda GFP flöresanı kullanılarak teyit edilebilir. Genel olarak, biyolüminesans olarak Şekil 1C ve 1D görsel olarak görülen, mesane tümörleri için ortalama ultrason boyutları ile ilişkili demek. Hayvanlar kurban edildi ve tümör GFP tarafından onaylandıktan sonra Ancak, biz bu biyolüminesans ultrason ölçümleri mi daha canlı tümör varlığı ile daha yakından ilişkili bulundu. Tedavi edilen farelerde rezidüel skar dokusu genellikle ultrason ile görüntülendi ama canlı tümör ayırt edilemedi çünkü bu Sarna (as kontrolleri aksine) ile tedavi edilen farelerde arasında özellikle belirgin oldu.
Şekil 1. Mesane tümörlerinin tümör büyüme kinetiği. (A) Bio-ışıldama, görüntüleme konumlarına ve büyüme teyit etmek için mesane tümörleri içinde lüsiferaz faaliyeti ölçülür. (B) 'in vivo olarak mesane ultrasond 40 MHz prob ile olan boyutları ölçülebilir tümör görüntüleri üretir. (C) Grafikler biyolüminesans ve ultrason boyutlarda tümörün sürekli artış gösteren. 6 hayvanlardan ölçümleri - Değerler (standart sapma + /) anlamına temsil eder. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Biz transkripsiyon aktivasyonu için p21 CIP1/WAF1 (p21) yükseltici hedefler LNP formüle Sarna ile tümörlerinin intravezikal tedavisi ardından bir fare ortotopik xenograft mesane tümörü modelinin kurulması için bir protokol mevcut. 2, 3 çıkan tümörler olabilir bioluminescent görüntüleme ve mesane ultrason ile doğrulandı ve izlenmelidir. Ortotopik modelleri idrar ve daha yakından endojen mesane kanseri yakın olduğunu ürotelium'un bir ortam sağlayarak periton, subkutan veya intravenöz modelleri üstün olabilir. Ortotopik fare mesane tümörlerinin çeşitli hem doğrudan hem de mesane duvar enjeksiyon gibi instillasyon kullanılarak kurulmuştur. Tümörün 4-8 intravezikal instilasyon, burada gösterdiği gibi, daha yakından mukozal epitelinde yüzeysel başlar ve derin büyümeye insan mesane tümörleri taklit Onlar ilerleme gibi. Blad karşılamak için gümüş nitrat kullanılarak Bizim yöntemiTümör alımı için Photoshop'ta ucuz ve teknik basittir.
Hadaschik ve ark. Farelerde mesane tümörlerinin instillasyon açıklanan ve güvenilir bioluminescent tümör değerlendirmesi. 5 Biz benzer kateterizasyon ve hücre damlatılması ile başarılı tümör implantasyonu yüksek oranlarda bulundu bildirdi. Bizim tümörler sadece tümör progresyonu ölçülmesi için ek bir yöntem sağlayan, aynı zamanda in vivo mesane ultrason ile biyolüminesans teyit edilmedi.
Bu protokol, biz başkalarının tekniği bazı değişiklikler unutmayın. Biz yerine elektrokoter tümör hücre implantasyonu için mesane ekstraselüler glikozaminoglikan tabakası, bozmaya gümüş nitrat solüsyonu damlatılması istihdam. Bu kullanıcı hatası potansiyeli minimize ucuz, basit ve güvenilir bir yöntem olarak bulundu. Mesane ultrason değerlendirilmesi sırasında, gereksiz üretral kateterizasyon gerçekleştirmek bulunduönceden. Hayvanın anestezi öncesi idrara çıkma neden önemli sıkıntıya maruz olmasaydı sürece, fare mesane güvenilir mükemmel bir tümör görüntüleme için izin görüntüleme sırasında şişmiş edildi. Hiç şüphesiz, üretral kateterizasyon protokolünün en güvenilir adımdı. Deneyimlerimize atimik çıplak farelerin kateterizasyon C57 farelerde daha zordur. Ancak, bu protokol ve video açıklanan tekniği ile, hayvanların% 90 üzerinde tekrar tekrar tümör damlatılması ve tedavi amacıyla başarıyla kateterize edildi.
LCL California San Francisco Üniversitesi tarafından açılan ve Alnylam İlaç için lisans almış Sarna ile ilgili patent başvurularının bekleyen bir adlandırılmış mucididir.
Bu araştırma AACR Henry Shepard Mesane Kanseri Araştırma Bursu (09-60-30-LI) tarafından finanse edilmektedir.
|Name||Company||Catalog Number||Comments|
|KU-7-luc-GFP cells||Caliper Life Sciences||128091|
|thymic nude mice ( nu/nu)||Simonsen Laboratories||6-7 weeks old||Sim:(NCr) nu/nu fisol|
|Ultrasound unit||VisualSonics, inc.||Vevo 770||RMV-704 probe|
|Bioluminescence unit||Caliper Life Sciences||IVIS Spectrum|
|Exel safelet catheter||Fisher Scientific||14-841-21||24G X ¾"|
|Silver nitrate||Sigma-Aldrich||S8157|
|Hamilton syringe||Hamilton Co||80301|
|LNP-saRNA||Alnylam Pharmaceuticals|
|Table 1. Specific reagents and equipment.|