POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (POLYMERASE CHAIN REACTION – PCR)
İlk DNA parmak izinin elde edildiği sene, 1985 senesinde, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bildirildi. PCR, spesifik bir DNA bölgesini çoğaltabilir. Bu teknik, adli genetik de dahil olmak üzere, tüm moleküler biyoloji alanında devrim yaratmıştır. PCR metodu, DNA’nın çoğaltılmasına izin verir.
DNA Repklikasyonu – PCR Temeli
PCR, DNA replikasyonunun enzimatik işlemlerinden faydalanır. Bir hücre döngüsü boyunca, hücremin tüm DNA içeriği ikiye katlanır. DNA’nın bu kopyalanması, spesifik bölgelerini çoğaltmak için hücre dışında, in vitro (yapay ortamda) çoğaltılabilir.
PCR’ın Bileşenleri
- DNA Şablonu: Örnekten ayrılmış, çift zincirli, ilgili DNA parçası (dsDNA – double stranded DNA)
- DNA Polimeraz: Genellikle, yüksek sıcaklıklarda (98 °C) hızlı bir şekilde denatüre olmayan ve yaklaşık 70 °C’lik optimum sıcaklıkta işlev görebilen bir termostabil Taq polimerazı.
[Taq Polimeraz: Tıpkı organizmalardaki replikasyon gibi, PCR da mevcut iplikçikleri şablon olarak kullanıp yeni DNA iplikçikleri oluşturan bir DNA polimeraz enzimine ihtiyaç duyar. PCR’da tipik olarak kullanılan DNA polimerazı adını, izole edildiği ısıya toleranslı Thermus aquaticus bakterisinden alır.
T. aquaticus, kaplıcalarda ve hidrotermal yarıklarda yaşar. DNA polimerazı ısıya oldukça dayanıklıdır ve en çok 70 °C’de aktiftir. Bu ısı stabilitesi, Taq polimerazı PCR için ideal kılar. Şablon DNA’yı denatüre etmek veya iplikçiklerini ayırmak için PCR’da tekrar tekrar yüksek sıcaklıkla işlem yapılır.]
- Oligonükleotid Primerleri: Hedef dizinin, yolcu ve rehber tellerinin 3’ uçlarına komplementer olan tek zincirli DNA’nın küçük parçaları.
- Deoksinükleotid Trifosfatlar: A, T, G ve C bazlarının tekli birimleri (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), polimerizasyon için enerji, DNA sentezi için yapı taşlarını sağlar.
- Tampon Sistemler: DNA denatürasyonu ile renatürasyonu için en uygun koşulları sağlamak üzere Mg ve K içerir. Ayrıca, polimeraz aktivitesi, kararlılık ve bağlılık için de önemlidir.
PCR Süreci
a. Denatürasyon: Tıpkı DNA replikasyonundaki gibi, DNA çift sarmalındaki iki zincirin ayrılması gerekmektedir.
Ayrılma, karışımın sıcaklığının arttırılmasıyla, komplementer DNA zincirleri arasındaki Hidrojen bağlarının kırılması sonucunda gerçekleşir. Bu olaya, denatürasyon denir.
b. Yeniden Birleşme: Primerler, hedef DNA dizilerine bağlanır ve polimerizasyonu başlatır. Bu, yalnızca çözeltinin sıcaklığı düşürüldüğünde gerçekleşebilir. Bir primer her bir zincire bağlanır.
c. Uzama: Yeni DNA, orijinal DNA’nın şablon olarak kullanılması ile oluşur. Bir DNA polimeraz enzimi, serbest DNA nükleotidlerini bir araya getirir. Bu enzim genellikle Taq polimerazdır. Serbest nükleotidlerin eklenme sırası, şablon DNA zincirindeki nükleotidlerin sekansı ile belirlenir.
Bir PCR döngüsünün sonucu, biri orijinal diğeri yeni üretilmiş iki iplik içeren, çift zincirli hedef DNA dizisidir.
PCR’ın kullanıldığı pek çok işlem büyük miktarda DNA gerektirdiği için, döngü birkaç kez tekrarlanır. Milyarlarca kopya almak ise yalnızca 2 ila 3 saat arasında sürer.
PCR İnhibitörleri
PCR inhibitörleri etkilerini genellikle, DNA ile direkt temas ile veya termostabil DNA polimerazlarına müdahele ile gösterirler. Ajanların tek veya çift sarmallı DNA’ya doğrudan bağlanması, amplifikasyonu önleyebilir; inhibitörün ve DNA’nın birlikte saflaştırılmasını kolaylaştırır. İnhibitörler ayrıca, enzim aktivitesini engellemek için bir DNA polimeraz ile doğrudan etkileşime geçebilir. DNA polimerazlar, inhibisyonun hedefi olabilecek kofaktör gereksinimlere sahiptir. Magnezyum kritik bir kofaktördür. Mg²⁺ varlığını azaltan ya da Mg²⁺’nın DNA polimeraza bağlanmasını engelleyen maddeler, PCR’ı inhibe edebilir.
Sevgili okurlarımız, Adli Genetik serimizin sonuna geldik. Umarız beğenmişsinizdir. Bilimle kalın, EKOG’la kalın!
Kaynaklar:
Making Sense of Forensic Genetics, Sense about Science, EuroForGen ile birlikte
An Introduction To Forensic Genetics, William Goodwin; Adrian Linacre; Sibte Hadi
An Introduction to PCR Inhibitors, Joseph Bessetti, Promega Corporation
Evidence Collection, Deborah A. Kleypas; William G. Gossman
sciencelearn.org.nz
khanacademy.org
laboratoryinfo.com
exploredna.co.uk