This action might not be possible to undo. Are you sure you want to continue?
Besiyerleri 1
Prof. Dr. A. Kadir Halkman Ankara Üniv. Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü 03.01. Genel Bilgiler 03.02. Kısa Tarihçe 03.03. Besiyeri Hazırlama Şekilleri #03.03.01. Formülden Hazırlama #03.03.02. Dehidre Besiyerlerinden Hazırlama #03.03.03. Kullanıma Hazır Besiyerleri #03.03.04. Özel Uygulamalar 03.04. Besiyeri Bileşimine Giren Maddeler #03.04.01. Su #03.04.02. Peptonlar #03.04.03. Maya Ekstraktı #03.04.04. Et Ekstraktı #03.04.05. Malt Ekstraktı #03.04.06. Beyin ve Kalp Ekstraktı #03.04.07. Agar #03.04.08. Karbohidratlar #03.04.09. Tuz #03.04.10. Tampon Maddeler #03.04.11. pH İndikatörleri #03.04.12. Redoks İndikatörleri #03.04.13. Diğer İndikatörler #03.04.14. İnhibitörler #03.04.15. Diğer Maddeler 03.05. Besiyeri Çeşitleri #03.05.01. Genel Besiyerleri #03.05.02. Selektif Besiyerleri #03.05.03. Diferansiyel (Ayırt Edici; Fark Ettirici) Besiyerleri #03.05.04. Zenginleştirme Besiyerleri #03.05.05. İdentifikasyon Besiyerleri #03.05.06. Diğerleri 03.06. Besiyerlerinin Hazırlanması #03.06.01. Cam Malzeme #03.06.02. Tartım ve Eritme #03.06.03. pH Ayarlama #03.06.04. Katkıların İlavesi #03.06.05. Petri Kutularına Döküm #03.06.06. Kurutma #03.06.07. Yeniden Eritme 03.07. Depolama #03.07.01. Dehidre Besiyerlerinin Depolanması #03.07.02. Çözeltilerin Depolanması #03.07.03. Katkıların Depolanması #03.07.04. Hazırlanmış Besiyerlerinin Depolanması 03.08. Çözeltilerin Hazırlanması 03.09. Besiyeri Kalite Kontrolü 03.10. Besiyeri Hataları 03.11. Tehlikeli Maddeler
www.mikrobiyoloji.org ana sayfasında görülen Merck Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamaları; "Anonymous, 2005. Merck Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamaları. Ed: A. K. Halkman. Başak Matbaacılık Ltd. Şti., Ankara, 358 sayfa." adlı kitabın 03. bölümüdür.
1
1
03.01. Genel Bilgiler
# Besiyerleri (besi ortamı, ortam, vasat, kültür ortamı, kültür vasatı, kültür besiyeri) mikroorganizmaların geliştirilmesi için formülize edilmiş ortamlardır. Bunlar, mikroorganizmaların geliştirilmesi, izolasyon, identifikasyon, sayım, duyarlılık testleri, sterilite testleri, klinik örneklerin incelenmesi, gıda, su ve çevre kontrolleri, biyolojik ürünlerin elde edilmesi, antibiyotik ve vitamin analizleri, endüstriyel analizler vb. gibi çok farklı amaçlara yönelik olabilir. # Besiyerleri çok farklı şekillerde hazırlanabilir ve kullanılabilir. Örneğin, süt bir "genel besiyeri" olup, mikroorganizmaların gelişmeleri için gerekli bütün besin maddelerini ve bunların kullanılabilmesi için yeterli suyu içerir. Üzüm suyunda da gelişme için gereken besin maddeleri ve su bulunmasına karşın, yüksek asitliği nedeni ile sadece bu asitlikte gelişebilecek olan mikroorganizmaların (bazı bakteriler ve özellikle mayaların) gelişimine uygundur. # Besiyerleri hakkında TS EN 12322; "Vücut Dışı Kullanılan Tıbbi Tanı CihazlarıMikrobiyoloji Kültür Besiyerleri- Kültür Besiyerlerinin Performans Kriterleri, Direktif: 93/42/EEC, 98/79/EC" adlı yayın Türk Standartları Enstitüsü'nden sağlanabilir. # #
03.02. Kısa Tarihçe
# Mikrobiyolojinin tarihçesinde kilometre taşı olarak anılan iki gelişme; 1674 yılında Antoni van Leeuwenhoek'un mikroskobu icat etmesi ve bundan yaklaşık 2 yüzyıl sonra 1881 yılında Robert Koch'un jelatin kullanarak elde ettiği katı besiyerinden Bacillus anthracis 'i izole etmesidir. Böylece, hastalık etmeni olan pek çok bakteri izole edilebilmiş ve "Hasta bireyden muhtemel hastalık etmenini saf halde izole et. Bu etmeni sağlıklı bireye aşıla. Hastalık semptomlarının aynı olduğunu izle. Hastalandırılmış bireyden saf halde izole edeceğin etmenin, ilk hasta bireyden izole ettiğin ile aynı olduğunu göster." şeklindeki Koch postulatı, giderek sistematik analiz yöntemi haline dönüşmüştür. Louis Pasteur tarafından 1882'de aşılamanın bulunması, 1928'de Alexander Fleming'in penisilini keşfetmesi de mikrobiyoloji tarihinin önemli kilometre taşları arasındadır. Bu bölümdeki amaç, tüm mikrobiyoloji tarihini vermek değildir ve bu konu, kitabın kapsamı dışında kalır. Aşağıda besiyerlerinin geliştirilmesi üzerine kısa bir kronoloji verilmiştir. #1817: Bartholomeo Bizio, ekmek üzerindeki kan gibi kırmızı renklenmelerin gerçekte ne olduğunu araştırmış, bunları mikroskop altında incelemiş ve mikroorganizmaları görmüştür. Kırmızı renkli sütlü ekmeği taze sütlü ekmeğe değdirerek, Serratia marcescens olarak adlandırdığı bu mikroorganizmanın gelişmesini sağlamış ve renklenmenin insan eliyle yapıldığını kanıtlamıştır. #1861: Louis Pasteur, mayaların oksijenli ve oksijensiz ortamda gelişimini inceleyip, bunların geliştirilmesi için sıvı besiyeri formülünü açıklayan ilk bilim adamı olarak tarihe geçmiştir. #1869: Ferdinand Cohn, besiyeri bileşiminde mineral maddelerin önemini göstermiştir. Böylece farklı grup mikroorganizmalar ile çalışma olanağı doğmuştur. #1872: Alman botanikçi Oscar Brefeld, sıvı besiyerine jelatin ekleyerek elde ettiği katı besiyerinde tek spordan küf kolonilerini ürettiğini bildirmiştir. #1873: Edwin Klebs, "fraksiyon yöntemi" olarak adlandırdığı bir seyreltme tekniği kullanarak ayrı kültürler elde eden ilk bakteriyologlardan biridir. Bu yöntem basit olarak, sıvı ortamdan 2
az miktarda örneğin başka bir besiyerine inokülasyonudur. Bu yöntemin dezavantajları karışık kültürlerden sadece baskın türün izole edilebilmesi ile çok fazla işgücü ve malzeme gerektirmesidir. #1877: John Tyndall, bugün Tindelizasyon olarak anılan ardışık ısıl işlem ile sterilizasyonu açıklamıştır. #1878: İlk saf kültür, "seyreltme tekniği" ile Joseph Lister tarafından elde edilmiştir. Lister, Pasteur'ün laktik fermentinden, sütte ekşimeye yol açan Bacterium lactis adını verdiği bakteriyi izole etmiştir. Bir öze ucu dolusu kesilmiş sütü steril kaynamış suya aktarmış, gerekli seyreltmeyi mikroskop kullanarak belirlemiş ve tek bakterinin olduğu seyreltiyi inokülasyon amacıyla kullanmıştır. #1880: İsviçreli bir botanikçi olan Karl Wilhelm von Nägeli, besiyeri hazırlamada pepton kullanımını öneren ilk bilim adamıdır. #1881: Robert Koch, aseptik olarak kesilmiş patates dilimlerinin, katı besiyeri olarak kullanımındaki yetersizliği üzerine, %10 jelatin eklenmiş sıvı besiyeri kullanarak Bacillus anthracis 'in saf kültürünü elde etmiştir. #1882: Koch'un çalışma arkadaşları olan Walter Hesse ile eşi Fanny Eilshemius Hesse tarafından katılaştırıcı olarak agar önerilmesi ile birlikte sıvı besiyerinin katılaştırılmasında yeni bir dönem başlamıştır. #1883: Gayon ve Gabriel Dupetit, şekerler ve alkoller gibi basit organik bileşiklerin kompleks organiklerin yerini alabileceğini göstermişlerdir. #1889: Limbourg, inhibitör olarak safra tuzları kullanmıştır. Safra tuzları (Ox Bile) günümüzde de koliform bakteriler için olan besiyerlerinin çoğunda bulunmaktadır. #1891: Coprrado, safranın B. mallei gelişmesini teşvik ederken, B. anthracis için bakterisit olduğunu ve B. typhosus ile B. pneumoniae üzerinde etkisi olmadığını gözlemiştir. Bu şekilde inhibitör kullanımı üzerinde yoğunlaşılmıştır. #1900: MacConkey ve Hill, Safra Tuzu Glikoz Broth'u fekal kontaminasyon için basit bir test olarak önermişlerdir. Hemen arkasından MacConkey bu besiyerinde B. enteritidis 'i geliştirmek için glikoz yerine laktoz kullanmıştır. #1902: Wilhelm von Drigalski ve Heinrich Conradi, Salmonella typhi ile E. coli 'yi ayırt etmek için bu iki bakterinin şeker metabolizmasındaki farkını kullanmayı önermişlerdir. Böylece, selektif izolasyon kavramı daha da belirginleşmiştir. #1908: Christiaan Eijkman, sıcak kanlı hayvanların bağırsağından izole edilmiş koliform bakterilerin Glikoz Broth besiyerinde, 46 °C'da inkübe edildiğinde gaz ürettiğini göstermiştir. Bu test günümüzde de benzer bir şekilde kullanılmaktadır. #1908: Prof. R. Doerr, laboratuvarlar için Petri kutusuna Nutrient Agar dökerek hazırlanan besiyeri önermiştir. #1909: Prof. E.L. Marx, laboratuvar ölçeğinde dehidre Nutrient Broth, Nutrient Agar ve Endo Agar formüllerine öncülük etmiştir. #1910: Amerikan Bakteriyologlar Derneği toplantısında W.D. Frost tarafından hazır besiyeri için benzer bir proses açıklanmıştır. #1910: İlk ticari besiyeri üretimi Nutrient Agar ve Nutrient Broth ile başlamıştır.
3
1 litre damıtık su içinde çözülür ve gerekli büyüklükteki cam kaplara dağıtılarak sterilize edilir.000001 g/L folik asit gibi tartımın da bulunduğu dikkate alındığında. pişirilerek "çorba" hazırlanır. EMB Agar. bileşimine 2 madde giren Nutrient Broth ile bileşimine 25 madde giren Lysine Medium besiyerleri uç noktalarda örneklendirilen besiyerleridir. Nutrient Broth'un bileşimi litrede 5 gram pepton ve 3 gram et ekstraktı şeklindedir. Besiyeri hazırlamak ise. # Kuşkusuz. Örneğin. patojenik enterobakteri tanımlama ve izolasyonu için kullanılmak üzere Eosin Methylene Blue Lactose Sucrose (EMB) Agar besiyerini geliştirmişlerdir. yabani maya izolasyonu ve sayımında kullanılan Lysine Medium besiyerinde 25 madde olduğu. 4 .#1916: Holt-Harris ve Teague. # # 03. bundan 8 gram tartılarak. önce un yağda kavrulur. süt ve tuz ilave edilir. günümüzde de kullanılan bir besiyeridir. # Besiyerinin bileşimi ister basit. ya da hazır dehidre besiyeri doğrudan tartılarak su içinde çözülür. aranmasında kullanılan BAT Agar ile özellikle Listeria monocytogenes aranmasında kullanılan ALOA Agar besiyerlerinin de standart bir laboratuvarda bileşimden hazırlanması oldukça güçtür. 1 litre damıtık su içinde çözülür ve yukarıdaki işleme devam edilir. domates çorbası yapmak için yemek kitaplarında miktarları verilerek tarif edildiği şekli ile. # Benzer şekilde. Ya da daha basit olarak. besiyeri bileşimine giren maddeler ayrı ayrı tartılarak. bileşimden hazırlamak yerine dehidre hazır besiyeri kullanmanın 3 önemli üstünlüğü vardır: #-Her maddeyi ayrı ayrı tartmak yerine hazır besiyerinden 1 kez tartım yapmak çok daha kolay ve güvenilir bir uygulamadır. bu tip besiyerlerini standart bir mikrobiyoloji laboratuvarında bileşimden hazırlamanın kolay ve günlük uygulamada hiçbir şekilde pratik olmadığı ortaya çıkar. bunlar doğrudan tartılıp. En basit olarak. #-Özellikle miligram düzeyinde tartım yapılacak besiyeri bileşenlerinde hata yapma olasılığı vardır. Besiyeri Hazırlama Şekilleri # Standart bir gıda mikrobiyolojisi laboratuvarı tipik bir ev mutfağına benzer. #1950: Granül besiyeri üretimine başlandı.03. # Alicyclobacillus spp. Oysa bu maddeler hazır dehidre besiyerleri içinde homojen dağıtıldıklarından tartımlar çok daha güvenilir olur. ister kompleks olsun. üzerine domates suyu. # Nutrient Broth gibi basit bir besiyerine giren maddeler. # Ancak. Dolayısı ile. Nutrient Broth'u bileşimden hazırlamak genellikle sorun değildir. bunlar arasında 0. çoğu mikrobiyoloji laboratuvarında her zaman "el altında" bulunur. evde yemek yapmaktan çok farklı değildir. Laboratuvarda hazır dehidre Nutrient Broth varsa. Laboratuvarda pepton ve et ekstraktı varsa. Mikrobiyolojik amaçla kullanılacak bir besiyerinin hazırlanması çok basit olarak mutfakta çorba yapmaya benzetilebilir. hazır toz haldeki domates çorbası belirli miktarda su ile pişirilir.
38 gram gerekir. ilave 6 su olduğuna göre molekül ağırlığı 120 + 108= 228 mol gram olarak hesaplanır. Genel olarak önerilen bir yöntem olmamakla birlikte.02.2 g/L MgSO4 yerine 0. Aradaki fark MgSO4. # 03. Pazarda düşük fiyatla satılan.6H2O'da ise.03. Ayrı ayrı tartılan bileşenlerden birisinin dahi özelliğini yitirmiş olması. # Örneğin. Özellikle yeni geliştirilen besiyerleri -güvenilirliklerini kanıtlayana ve/veya yeterli pazarlama potansiyeline ulaşıncaya kadar. Buna göre bileşenlerin bir ya da bir kısmının performansında kayda değer düşme olmuş ise. o madde ile hazırlanan besiyerinin performansında kayda değer ölçüde kayba.6H2O kullanılması aynı anlama gelmektedir. #-Özellikle çeşitli bilimsel araştırmalarda yeni ve modifiye besiyeri çalışmaları için bileşenlerin ayrı ayrı kullanılması gerekmektedir. ancak kayda değer düzeyde performans eksikliği olan markaların bulunduğu da dikkate alınmalıdır. hatta o besiyerinin tümüyle kullanılamaz hale gelmesine yol açar. # 5 . bu düşüş doğrudan besiyeri performansına yansıyacaktır. # 03. # MgSO4'ın molekül ağırlığı Mg: 24. # Buna göre. # Besiyerlerinin bileşimine çok genel bir ortalama olarak 5–7 madde girer. bazen bileşime giren malzemelerin tümü formülde verildiği şekli ile laboratuvarda bulunmaz.03. Formülden Hazırlama # Yukarıda çeşitli örnekleri verildiği gibi besiyeri bileşenlerinin ayrı ayrı tartılarak besiyerinin hazırlanma şeklidir. bu nedenle cazip gösterilen.20 gram gerekiyorsa Mol ağırlığı 228 olan maddeden 0. Laboratuvarın kimyasal madde deposunda MgSO4 yok. Laboratuvarda bulunabilen bu bileşenlerin tümünün yeterli performans göstermesi beklenmemelidir. laktik asit bakterileri için kullanılan MRS Agar besiyerinin formülünde MgSO4 0.2 g/L olarak verilmektedir. # Burada dikkat edilmesi gereken konu kalitedir.6H2O'da bulunan sudan kaynaklanmaktadır. # Besiyerinin bileşimden hazırlanması gerektiğinde.01. aşağıda verilen 2 koşulda besiyerinin bileşim üzerinden hazırlanması bir anlamda zorunludur: #-Her besiyerinin ticari olarak pazarlanan dehidre hazır besiyeri formu yoktur.#-Hazır besiyeri kullanmanın en önemli üstünlüğü -hatta bir diğer deyiş ile zorunluluğubileşenlerin performansı ile ilgilidir. O: 16 (4 atom oksijen olduğuna göre 4 X 16= 64) olmak üzere 120 mol gramdır.besiyeri üreticisi firmalar tarafından dehidre halde hazırlanmamaktadır. Özellikle organik bileşenlerin depolanma ömürleri anorganik maddelere göre çok daha kısadır. 0.6H2O varsa molekül ağırlığı üzerinden hesaplanarak kullanılabilir. ama bunun yerine MgSO4. # İkinci aşamada basit orantı kurulur: Mol ağırlığı 120 olan maddeden 0. S: 32. Dehidre Besiyerlerinden Hazırlama # Besiyeri üreticisi firmalar tarafından üretilmiş dehidre besiyerleri kullanımının tartışılmaz bir üstünlüğü vardır. MgSO4.38 g/L MgSO4.
sularda koliform grup bakteri ve E. coli aranması ya da sayılması için en yaygın uygulamalardan biri. su örneğinin membran filtreden geçirilip. Serum içine steril koşullarda ilave edilen besiyeri kolaylıkla erir ve inkübasyon sonunda bulanıklık oluşursa serumun steril olmadığı anlaşılır. steril dehidre besiyerini. vida kapaklı tüp ve şişelerde sıvı ve katı besiyerleri ile oldukça yaygın olarak Petri kutularında agarlı besiyerleridir. dilüsyon şişesi. Bu tip besiyerleri uygun bir pede emdirilmiş. Burada. coli ile enterokok analizinde kullanılan ReadyCult sistemi sırası ile 12. # Mikrobiyolojide. besiyerinin konsantrasyonu yarı yarıya azalır ve burada sağlıklı bir mikrobiyel gelişme olmaz.02.03. Özel Uygulamalar # Standart bir gıda mikrobiyolojisi laboratuvarında kullanılan besiyerlerinin tamamına yakını tüpte ya da erlende (balon. Bunların bir yüzü maya–küf. başlangıçta bu besiyerleri çift kuvvette (2 misli konsantrasyonda) 6 . Işınlanmış Tryptic Soy Broth yönteminde ise böyle bir olumsuzluk yoktur. Kullanıma Hazır Besiyerleri # 1950'li yıllardan bu yana.03. bazı besiyeri üreticisi firmalar tarafından kullanıma hazır halde besiyerleri üretilmekte ve pazarlanmaktadır. başta sayım ve var/yok testlerinde kullanılmak üzere çeşitli amaçlarla membran filtreler kullanılmaktadır.03.1µ porlu membran filtrelerden geçebilir ve bu nedenle membran filtre tekniği ile bu gibi bakterilerin varlığı fark edilemez. Bunlara ilaveten. plastik Petri kutularında hazırlanan agarlı besiyerleri sadece tek çeşit besiyerini içerebileceği gibi. # Yüzey kontaminasyonlarının belirlenmesi ve/veya kültürlerin taşınmasında kullanılan hazır agar slaytları da bulunmaktadır. Bu tip besiyerlerini kullanmak işletme laboratuvarında büyük kolaylık sağlamaktadır. 07. # 03. ve 22. Bölümlerde verilmiştir. # Kullanıma hazır besiyerleri içinde bir diğer yaklaşım gama radyasyonu ile sterilize edilmiş dehidre besiyerleridir.03. Pseudomonas pseudoflava) gibi küçük bakteriler ve Acholeplasma laidlawii gibi mikoplazmalar 0. diğer yüzü toplam bakteri vb. kurutulmuş ve plastik bir kutu içine konularak sterilize edilmiş bir şekilde pazarlanmaktadır Kullanıcı için yapılacak tek işlem pedi steril su ile ıslatmak ve filtreyi bu pede yerleştirerek inkübasyona bırakmaktadır. steril kap içinde. # Çift kuvvetli broth: EMS ile yapılan sayımda (bakınız. Aynı yaklaşım ile.03. bu filtrenin uygun bir katı besiyerine yerleştirilerek inkübasyona bırakılmasıdır. Bölümde anlatılmıştır.) broth formunda ve Petri kutularında agar formunda hazırlanır. Bu testin mantığı.01. Bunlar içinde en yaygın kullanılanlardan biri Kanlı (Blood) Agardır. steril olması gereken sıvı ile çözerek bir çeşit besiyeri hazırlamaktır. bu amaçla hazırlanmış özel besiyerleri de kullanılabilir. aşağıda verilen kullanım amaçlarına yönelik olarak özel hazırlama şekilleri de bulunmaktadır. Bunun önüne geçmek için. Örneğin. vb. amaca uygun bir şekilde hazırlanmış ve Petri kutusuna dökülmüş bir katı besiyeri kullanılabileceği gibi.01. Genellikle. Bunlar. genellikle serum gibi steril olması gereken tıbbi malzemede sterilite testi yapmak için kullanılır. Bu besiyerinin neden hazır halde sağlanması gerektiği ve bu uygulamanın neden daha ucuz olduğu 10. iki ya da üçe bölünmüş kutularda farklı besiyerleri de bulunabilmektedir. Membran filtrasyon sisteminde bazı sporlar ile Hydrogenophaga pseudoflava (Syn. Bu hazır besiyerlerinin 2 farklı yüzünde 2 farklı besiyeri bulunan tipleri aynı örnekte hem toplam bakteri hem de koliform grup bakteri analizine olanak sağlamaktadır. Bölüm) 10 mL besiyerine 10 mL örnek aktarıldığında. 10 mL gıda örneği (homojenizat) ilave edilecek tüplerde.04. çeşitleri de vardır. içme ve kullanma sularında E. Bunlardan ışınlanmış Tryptic Soy Broth.
Temel amaç.355 g madde vardır. bunun üzerine 10 mL örnek konulduğunda LST konsantrasyonu 0. koliform grup bakteri analizinde kullanılan LST Broth besiyeri normal olarak 35. analizinde kullanılan Triple Sugar Iron Agar en tipik örnektir.hazırlanır. #########(+)###(–) Standart otoklavlamada tüpte kalan hava çıkar.71 g/10 mL) olarak hazırlanır. pek çok amaçlarla kullanılan agarlı besiyeridir. standart tüpün içine önce Durham tüpünün atılması. Bu uygulamada genellikle aynı besiyeri kullanılmakla beraber. Amaç. dökme yönteminde besiyerinin tam jelleşmesinden sonra. Besiyeri hazırlanırken. Durham Tüpü bakterilerin analizinde laktozdan gaz oluşumu tipik bir reaksiyondur. Bu aşamada dikkat edilmesi gereken husus. Yatık Agar Hazırlanması koleksiyonu vb. Başta basiller olmak üzere aerobik bakteriler bu ortamda yine gelişir. standart tüpün içine ters olarak yerleştirilen ve Durham tüpü olarak adlandırılan küçük tüplerde gaz birikimiyle anlaşılır. Roux Şişesi Roux Şişesi: Genel olarak. Yayma ya da dökme yöntemiyle standart ekimde. # Tüpte yatık agar: Tanımlama.5 g/L konsantrasyonda hazırlandığında.71 g/10 mL'den 0. kültür Şekil 02. Örneğin. ancak yayılıcı koloni oluşturamazlar. üzerine besiyeri ilavesi ile sterilizasyon öncesinde daha az hava kalması sağlanır. Salmonella spp. Bu tip ekimler için yeteri büyüklükte tüp kullanılmalıdır. Otoklav sonrasında besiyeri henüz sıvı iken tüpler bir çubuk üzerine yatırılarak katılaşması sağlanır.355 g/10 mL standart değere iner. İnkübasyon sonrası yıkama ile kültür elde edilir. Yüzey alanı 250 cm2 kadardır. # Durham tüpü olan besiyerleri: Koliform grup Şekil 04. tüpte geniş bir yüzey elde etmektir. Çift Kat Ekim: Koliform grup bakteri ekiminde yaygın olarak uygulanır. tüplerin dip kısımlarının yaklaşık 2. # Şekil 03. 10 mL tüp içinde 0. çok miktarda mikroorganizma kültürü elde etmek amacı ile kullanılır. Bu amaçla toplam bakteri sayımında da çift kat ekim yapılabilir. Buna göre 100 mL kadar agarlı besiyeri ile birlikte sterilize edilir. Geniş ağzından sürtme (svap) çubuğu yardımı ile yoğun bir inokülasyon yapılabilir. yayma yönteminde ise besiyerinin yayılan kültürü tam emmesi için 10 dakika beklendikten sonra üzerine 4–5 mL kadar ikinci kat besiyeri dökülür. Eğer toplam bakteri analizinde çift kat ekim yapıldı ise analiz raporunda bu durum belirtilmelidir. Besiyerinde gaz çıkışı.5 cm derinliğinde olmasıdır. Bu işlem. Çift kuvvetle hazırlanması gerektiğinde. kısmi bir mikroaerofil ortam yaratmaktır. Otoklav sonrasında düzgün bir yere yatırılarak agarın donması Üstten görünüş sağlanır. Standart deney tüplerine 7 mL olacak şekilde tam olarak eritilmiş agarlı besiyeri dağıtılır ve otoklavlanır. # 7 . özel çalışmalar amacıyla farklı bir besiyeri de kullanılabilir. hasat Karşıdan görünüş (harvesting) olarak da adlandırılır. başlangıçta 71 g/L (0.
Bu gibi bakterilerle çalışıldığında suyun çok özenle hazırlanması gerekir. Dolayısıyla bu analizler için. NaOH ile nötral pH'ya getirilir ve saf su sistemi kontrol edilir. Eğer saf suyun pH'sı 5. doğal kaynak suları besiyeri hazırlanması amacıyla kullanılabilir. doğal kaynak suları bu amaçla kullanılıyor ise belirli aralıklarla (örneğin üç ayda bir) kullanılan 8 . c)Diğerleri olmak üzere 3 gruba ayrılabilir. # Suyun çok kireçli olduğu bölgelerde damıtık su elde edilmesi bazen sorun olmaktadır. # Besiyeri bileşimine giren maddeler gelişme açısından. pek çok madde de besiyeri bileşimine girer. # Taze hazırlanmış saf suyun pH'sı 6. bu su ısıtılarak CO2 uzaklaştırılır ve pH yeniden kontrol edilir. Depolanmış saf su atmosferik karbondioksitin absorbe edilmesi sonucu asit pH gösterir. Bütün besin öğelerini oldukça fazla miktarda sağlayarak. Tersine olarak.04. # Gerek deiyonize gerek damıtık su elde edilmesinde saf su sisteminin ve benzer şekilde saf suyun depolandığı kapların belirli aralıklarla temizlenmesi gerekir.01.03. Gelişme için gerekli olan maddeler doğrudan mikroorganizmaların beslenme şekilleri ile ilgilidir ve besiyeri içinde bir anlamda zorunlu olarak bulunur. Besiyeri hazırlamada kullanılan su asidik özellik gösteriyorsa ve besiyeri bileşimde bikarbonat tamponlar varsa. hedef organizmanın gelişmesini optimize edecek konsantrasyonlarda gerekli besin maddelerinin dengelenmiş karışımını sağlamaktır. Bunların dışında yine gerektiğinde indikatörler.5 arasında olmalıdır. İyon değiştirici reçineden geçirilerek elde edilen deiyonize (demineralize) su kullanıldığında bunun içinde yüksek sayıda mikroorganizma bulunabileceği dikkate alınmalıdır. cam sistemlerden elde edilen suyun kullanılmasıdır. Eğer pH hala düşük ise. jelleştiriciler vb. # İnhibitörler ise gelişmesi istenmeyen mikroorganizmalar için gerektiğinde selektif besiyerlerine ilave edilir. Su # Besiyeri hazırlamada kullanılan suyun damıtma veya deiyonizasyon ile taze hazırlanmış olması. a)Gelişme için gerekli olanlar.5–7. Bu kaplarda zamanla alg gelişimi olabilir ve alg metabolitleri bazı duyarlı mikroorganizmaların gelişimini baskılayabilir. ilişkili bir amino asidin gelişme için kullanımını baskılayabilir. konsantrasyonları arttıkça baskılayıcı etki yaparlar. b)İnhibitörler. bunları etkileyerek hazırlanan besiyerinde bir takım olumsuzluklara yol açabilir. # 03. besiyeri hazırlamada kullanılan suyun içindeki safsızlıklara karşı çok duyarlıdır. Ancak.5'in altında ise. Bu gibi yerlerde besiyeri hazırlamada doğal kaynak sularının kullanılması mümkündür. aminoasitlerin dengelenmemesi ve bir amino asidin fazla olması. olabildiğince zengin bir besiyeri yapma yaklaşımı ile optimal besiyeri elde edilemez. başta bakır olmak üzere toksik metalleri içermemesi gerekir. Glikoz dahil olmak üzere tüm besin öğeleri. # Örneğin.04. # Özellikle klinik ve veteriner mikrobiyolojiyi ilgilendiren bazı bakteriler. gıda mikrobiyolojisini ilgilendiren ve günlük (rutin) olarak analizleri yapılan mikroorganizmalar bu tip maddelere genellikle duyarlı değildir. Besiyeri Bileşimine Giren Maddeler # Besiyerleri hazırlanırken amaç. Damıtık (distile) su için en ideali.
Cr. Bu kriterler sağlanamıyor ise.02. # Ham madde ve üretim yöntemi farklılığı doğal olarak peptonların bileşimlerinde de farklılıklar oluşturur. mikroorganizma gruplarının oldukça büyük bir bölümü. İstisnalar dışında. Koch'un çalışma arkadaşlarından Nägeli tarafından 1880 yılında kullanılmıştır. Cu. Buna göre.0 umhos/cm'den daha az olması gerekir. Peptonlar # Pepton terimi.000 kob/mL'den. Yılda bir kere toplam metaller (Pb. bu kriterlerden en az birisini sağlamalıdır. Ni ve Zn) için yapılan analizde. # Proteinler. proteinlerin hidrolizi ile elde edilen ürünlere verilen genel isimdir. karbon. tuzlar ve diğer besin maddelerine gereksinim duyarlar. Benzer şekilde toplam klor kalıntısı negatif ya da kullanılan testin belirleme sınırından daha az olmalıdır. Akü suyu.000 Wcm direnç ve en fazla 10 mS (microSiemens) kondüktivite (iletkenlik) göstermesi. Bu terim ilk kez R. Bu amaçla en çok kullanılan proteolitik enzimler papain. kemoorganotrof mikroorganizmaların kısmen parçalanmış (hazmedilmiş.5 megohm/cm ya da kondüktans 2. # Yaşayan tüm hücrelerde olduğu gibi mikroorganizmalar da azot. en az 300. Burada değinilen fiziksel değerler farklı kaynaklardan elde edilmiştir. kuvvetli asitler ve kuvvetli alkaliler ile ya da enzimatik olarak temel bileşenleri olan peptit ve aminoasitlere ayrışır. Cd. # Peptonlar sadece azot değil. sütten ve soyadan farklı yöntemlerle elde edilir ve farklı ticari isimlerle pazarlanır ve/veya dehidre besiyerleri içine katılır. # Kaynağı ne olursa olsun. sindirilmiş) protein içeren besiyerinde iyi geliştiklerini açıklayan ilk bilim adamıdır. ütü suyu gibi adlarla satılan suların kaynağı ve elde ediliş şekli bilinmedikçe kullanılmalarından olabildiğince kaçınılmalıdır. Birden fazla kriter test edildiğinde bunlardan birini sağlıyor. Bu deneme basit olarak. her bir metal 0. # 03. aminoasit zincirlerinden oluşmuş makro moleküllerdir.suyun -ya da bu su kullanılarak hazırlanmış besiyeri örneklerinin. Dolayısı ile değişik amaçlar için farklı peptonlar kullanılır.05 mg/L'yi ve metaller toplamı 0.bir dış laboratuvara gönderilerek standart şekilde hazırlanmış besiyerine karşı performans denemesi yapılmalıdır. besiyeri hazırlamada kullanılan suyun besin maddelerini ya da inhibe edici maddeleri içermemesi. karbon kaynağı olarak da mikroorganizmalar tarafından kullanılır. eğer su depolanmış ise 10. Bu nedenle azotlu bileşikleri. Aminoasitler birbirlerine peptit bağları ile bağlanırken 1 molekül su açığa çıkar.1 mg/L'yi geçmemelidir.000 kob/mL'den az olmalıdır. ancak diğer(ler)ini sağlamıyorsa bunun nedeni araştırılmalıdır. Proteinler. aynı gıda örneğinden iki farklı besiyerine ekim ve sayım sonuçlarının karşılaştırılması şeklindedir.04. # Peptonlar. Bunun yanında. 25 °C'da rezistans 0. pepsin ve pankreatindir. çok daha kolay kullanabildikleri protein hidrolizatlarından sağlar. kullanılacak su. Peptit bağlarının kuvvetli asitler 9 . Nägeli. düzeltici ve tekrarını önleyici faaliyet (eylem) yapılmalı ve kayda geçilmelidir. peptonların bileşiminde bulunan bazı aminoasitler ve vitaminler de bazı mikroorganizmalar için gelişme faktörü olarak oldukça önemli işlev görür. # Besiyeri hazırlamada kullanılan suda ayda bir olarak yapılacak ölçümlerde toplam bakteri sayısı 1. proteinleri azot kaynağı olarak kolaylıkla kullanamaz. birçok ticari firma tarafından çeşitli hayvansal dokulardan.
Özellikle. asparagin ve glutamin etkilenmez. elde edilen peptonda kullanılan enzimin çeşidine göre protein parçalanma ürünü olan polipeptitler bulunur. Maya Ekstraktı # Maya ekstraktı (maya özütü.kullanılarak. # Günümüzde ticari olarak üretilen ve pazarlanan peptonların hemen hemen tümü enzimatik olarak elde edilmektedir.03. Bu işlem sırasında karbohidratlar ile aminoasitler arasında meydana gelen bir seri reaksiyon sonunda oluşan bazı kimyasallar. mikrobiyolojide "pepton" denildiğinde. Bu pepton ticari firmalar tarafından farklı isimlerle anılır. Bu işlem sırasında bazı aminoasitler (örneğin triptofan) tümüyle kaybolur. yüksek B kompleks vitamini konsantrasyonu sayesinde çoğu mikroorganizmanın iyi bir şekilde gelişmesini sağlar. mikroorganizma gelişimi için toksik olur. # Proteinlerin enzimatik olarak parçalanması -asit hidrolizine göre. # Bileşimindeki aminoasitler. # Aksine bir belirtme yoksa.pepton bileşimine daha az zarar verir. # Besiyeri formülden hazırlanmak zorunda ise. peptitler. aşı üretimi için bitki kökenli peptonlar uygun değildir. bitkisel peptonlar enzim üretiminde başarılı bir şekilde kullanılabilir. Benzer şekilde. Bu nedenle. yüksek basınç ve yüksek sıcaklık altında tam olarak kırılması. sistin. Pek çok bakteri. vitaminler. sadece bu bağlarda parçalanmaya neden olur. Dolayısıyla. mikroorganizma için yeterli azot kaynağı sağlayacak düzeyde -sadece bir kısmınınkırılması hedef alınır. # Peptonlar mikrobiyolojide tek başlarına besiyeri olarak kullanılabilen ender maddeler arasındadır. böylece proteinin tümüyle kendisini oluşturan aminoasitlere dönüştürülmesi mümkün değildir. karbohidratlar ve mineraller nedeniyle pek çok mikrobiyolojik çalışmada besiyeri katkısı olarak kullanılır. pepton bünyesindeki vitaminler ciddi ölçüde zarar görür. pankreatin enzimi ile hidrolize edilmiş et peptonu (Peptone from meat.04. # Mikrobiyolojinin değişik alanlarında farklı peptonlar kullanılır. formülde verilen peptonun kullanılması gereklidir. # # 03. serin ve treonin zarar görürken. pancreatic) anlaşılır. Teorik olarak farklı enzimler kullanılarak. Sadece kazein. proteini oluşturan tüm aminoasitlere kadar parçalanma mümkün ise de bunun pratik bir önemi yoktur ve besiyeri bileşiminde kullanılacak proteinler sadece -amaca uygun şekilde. Kullanılan enzimler peptit bağlarına özel olup. yeast extract). Karbohidrat içermesi nedeniyle karbohidratlardan asit oluşturma testlerinde kullanılmaz. kuvvetli asitler ile peptonların elde edilmesinde peptit bağlarının tümden değil. asidik reaksiyon ile hidrolize edilir. # 10 . Son zamanlarda BSE tehlikesine karşı bazı ticari firmalar hayvansal dokulardan elde edilen peptonların BSE içermediğine ilişkin sertifika vermektedir. proteolitik olarak otolize edilmiş (parçalanmış) bira mayasının (Saccharomyces cerevisiae) sulu ekstraksiyonu ile elde edilir. bileşimi sadece %1 pepton olan besiyerinde kolaylıkla geliştirilebilir. Buna karşın. Besiyerlerinin bileşiminde farklı peptonlar kullanılabilirken.belirli düzeyde parçalanarak peptonlar elde edilir. Bazik olarak elde edilen peptonun ticari üretimi yoktur.
Beyin ve Kalp Ekstraktı # Beyin ekstraktı (brain extract) ve kalp ekstraktı (heart extract) streptokoklar. # 03. Malt Ekstraktı # Malt ekstraktı (malt özütü. Çeşitli besiyerlerinde et peptonlarının yerini alabilir. meat extract).04. Uzun ve dallanmış zincir yapısı nedeniyle -bir kaç istisna dışında.7 konsantrasyondaki çözeltisi maya ve küflerin geliştirilmesi için uygun bir besiyeridir. Eucheuma. Acanthopeltis. genellikle yağı ve tendonları ayrılmış.04. Bazı hidroksil grupları sülfürik asit ile esterleştirilmiştir. Pterocladia türleri) elde edilir. "Agarophytes" olarak adlandırılan bazı kırmızı deniz yosunlarından (Gelidium. biralık arpanın çimlendirilmesi ve kavrulması ile elde edilen malttan üretilir. # 11 . Agar bir poligalaktozid olup. besiyeri bileşimine sadece jelleştirici olarak katılır. # Agar. Et Ekstraktı # Et ekstraktı (et özütü. # Agarın katılaştırma (jelleştirme) özelliğini bileşimindeki D-galakton sağlar. Ayrıca. Agaroz.06.04. Çoğu kez diğer agarlı besiyerleri ile karıştırılmaması için "agar agar" olarak anılır. Ahnfeltia. Bileşiminde ayrıca inorganik tuzlar. ekstraksiyon öncesi hafifçe hidrolize edilmiş etten elde edilir. gibi zor gelişen (fastidious) patojen bakterilerin geliştirilmesi için Brain Heart Broth ve Brain Heart Infusion gibi isimlerle anılan besiyerlerinin bileşimine katılır. Bu nedenle karbohidratlardan asit oluşturma testlerinde kullanılabilir. Gerekirse bu çözelti çeşitli peptonlar ile desteklenebilir ve/veya asitlendirilebilir ve/veya agar ve pepton eklenerek Malt Extract Agar şeklinde katı besiyeri olarak kullanılabilir. Böylelikle B kompleks vitaminleri korunmuş olur. meningokoklar. malt extract). çeşitli karbohidratların yüksek konsantrasyonuna bağlı olarak maya ve küflerin geliştirilmesi için kullanılır. çeşitli toksin testleri için patojenlerin bu besiyerinde geliştirilmesi önerilmektedir. %1. Karbohidrat içermez. Bileşiminde bulunan agaroz ve agaropektin adlı iki polisakkarit. Agar # Besiyerlerinin katı hale getirilmesi için en çok kullanılan jelleştiricidir.05. pneumokoklar.04. gonokoklar vb. yeteri kadar saf olmadığı için mikrobiyolojik analizlerde kullanılamaz. Agardaki agaroz oranı en çok %75'e kadar çıkabilir. Mikrobiyolojik kullanım amacıyla en iyi kalitedeki agar Gelidium türünden elde edilir. Mikrobiyolojide kullanılan agarlar özel olarak saflaştırılarak antimikrobiyel maddeler ve pigmentlerden arındırılır.04. Özel çalışmalarda saf agaroz kullanılır. # 03. Gracilaria.Maya ekstraktı üretiminde otoliz düzeyi sürekli olarak kontrol edilir ve otolitik aktivite ısıtma ile durdurulur.mikroorganizmalar tarafından besin maddesi olarak kullanılamaz. # 03. çok az miktarda protein benzeri maddeler ve eser miktarda yağ vardır. Gıda sanayisinde de jelleştirici olarak kullanılan agar. agaropektin viskoz özellik verir. Agardaki agaroz/agaropektin oranı ham maddeye göre değişir. Başta maltoz olmak üzere. agarın etkisini belirler. # 03.07. agarın yüksek jelleştirme özelliğinden sorumlu iken.
Gerek erime gerek jelleşme sıcaklığına besiyeri pH'sı etkilidir. sellobiyoz. # Adonitol. levuloz (früktoz). maltoz.07.08. rafinoz. Bölüm). Düşük agar konsantrasyonları (%0.3) genellikle hareketliliğin belirlenmesi. laktoz sakkaroz. Bunlardan glikoz pek çok bakteri tarafından kullanılabildiği için.Yaklaşık olarak 85–90 oC'da erir. 37. Çeşitli besiyerlerinin bileşimine katılan glikoz. inositol. sakkaroz (sukroz). laktoz ve sakkarozdur. mannitol gibi bazı karbohidratlar çeşitli katı besiyerlerine yine karbohidratlardan asit oluşumunun izlenmesi ve buna göre koloninin ön identifikasyonu amacı ile katılır. mannoz.04. Bölüm). mikroaerofil karakterdeki bakterilerin geliştirilmesi gibi özel amaçlarla kullanılır. salisin. pH'sı 5 ve daha altında olacak ise. 40–45 oC'da jelleşir. # Agarın jelleşme sıcaklığı literatürde 32–39 oC olarak verilmektedir. laktoz. 6'dan daha düşük pH'ya sahip besiyerlerinde genel olarak daha fazla agar kullanılır. ancak düşük pH'dan olumsuz şekilde etkilenir. laktoz. 03. sakkaroz gibi şekerler besiyeri ile birlikte otoklavda da sterilize edilebilir. sorbitol.04. melibiyoz.03. selüloz. galaktoz.05–2 gibi geniş bir sınırda ilave edilebilir. Daha yüksek agar konsantrasyonu bu olumsuzluğu gidermek içindir. Karbohidratlar # Bazı besiyerlerinin bileşimine bakteriler için enerji ve karbon kaynağı olarak katılan karbohidratların bir başka kullanım şekli karbohidratlardan asit oluşturmaya dayalı identifikasyon testleridir (bakınız. # Koliform grubu bakterilerin geliştirileceği besiyerlerinin hemen hepsinde karbon kaynağı olarak laktoz kullanılır. # Glikoz. Besiyeri pH'sını etkilemez. bu besiyeri nötral pH'da otoklavlanır ve 45 oC'a soğutulup. # Besiyeri bileşiminde karbon kaynağı olarak en çok kullanılan karbohidratlar glikoz. arabinoz. nişasta. dekstroz (glikoz).05–0. Gaz çıkışı basit olarak Durham tüpü ile belirlenir (bakınız. # 03. # Nişasta kullanımı (hidrolizi) bazı bakteriler için tipik olduğundan çeşitli özel besiyerlerinin bileşimine katılır. daha çok genel besiyeri bileşimlerinde yer alır. # Besiyerine amaca göre %0. Yüksek konsantrasyonlar ise yüksek asitli besiyerlerinde agarın jelleşme özelliğini koruması amacıyla kullanılır. Yukarıda da belirtildiği gibi agar yüksek sıcaklıkta yüksek asitlikten olumsuz etkilenir. trehaloz ve ksiloz çeşitli karbohidrat testlerinde kullanılmak üzere çoğunlukla sıvı ya da katı besiyerlerine katılabilmektedir. Koliformların analizi için hazırlanmış sıvı besiyerlerinde laktozdan gaz oluşumu bu grup için belirleyicidir. ramnoz. mannitol. # Genel olarak karbohidratların çözelti halinde filtrasyon ile sterilize edilmesi önerilir. gerekli miktar asit ilave edilir. melezitoz. Standart kullanım konsantrasyonu %1–1. # 12 . inulin. dulsitol. Döküm sırasında Petri kutularının oda sıcaklığında (20 oC) olduğu ve dolayısıyla Petri kutusu ile besiyeri arasında ısı değişimi olacağı dikkate alınarak döküm sıcaklığının 40–45 oC kadar olması gerekir.5'tir. Bu şekilde hazırlanmış besiyerleri tekrar eritilirse agar jelleşme özelliğini tümüyle yitirir.
03. # Örnek: pH'sı 5.8–8. Tuz # Aksine bir belirtme yoksa "tuz" denilince sodyum klorür anlaşılır. belirli pH aralığında tutmak üzere "pH–stat" denilen sistemlerle dışarıdan asit ya da baz ilavesi ile yapılır. Skim Milk besiyerine 1 g/10 mL kalsiyum karbonat ilavesi ile laktik asit bakterilerinin oluşturduğu asitlik kayda değer ölçüde tamponlanır. Buna göre. Tersine olarak geliştirilmesi istenen mikroorganizma yüksek asitliğe veya yüksek alkaliliğe dirençli ise. Çoğu besiyerinin bileşimine izotonik bir ortam oluşturmak için katılır.073 g/L KH2PO4) Çözelti "B": 0.0 arasında tampon çözelti hazırlamak için kullanılan tamponlar gösterilmiştir.10. bazıları (örneğin mayalar. Klinik birimlerde bu ad ile bilinen çözelti de budur ve insan vücudu için de aynı şekilde izotonik denge oluşturur.80 mL bulunur. # Tuza dayanıklı (halotolerant) ve tuz seven (halofil) bakterilerin selektif izolasyonu için yüksek konsantrasyonlarda özel besiyerlerinin bileşimine katılır. çizelgeden 5.90'ın karşılığı olarak 9. besiyeri pH'sı bu mikroorganizmanın gelişebileceği pH'ya ayarlanmalıdır. asidofilik bakterilerin geliştirileceği ortamlarda pH düşürülerek pek çok bakterinin gelişmesi kayda değer ölçüde baskılanır. fosfatlar (K2HPO4.90 olan tampon çözelti hazırlanmak isteniyorsa. Örneğin maya ve küflerin. Sadece pepton olan ortamda geliştirilen bakteriler pH'yı yükseltir.85 NaCl. %0. karbonatlar.866 g/L Na2HPO4). Basit olarak. Bazı çalışmalarda inkübasyon sırasında pH'nın değişmesi. ß gliserofosfat). asetatlar ve sitratlardır. # Asitlik/alkalilik. besiyerlerine selektivite kazandırmak amacıyla.04. Tampon Maddeler # Mikroorganizmalar genel olarak nötr ve nötre yakın pH'larda iyi gelişir. küfler. pH değişiminin minimumda tutulması amacıyla besiyerine çeşitli tampon maddeler ilave edilir. serum fizyolojik adı ile seyreltme çözeltisi olarak yaygın olarak kullanılır. Çözelti "A": 0. geliştirilmesi istenen mikroorganizmaya zarar vereceği için istenmez. Buna karşın bileşiminde pepton yanında karbohidrat da olan besiyerinde karbohidrat tükenmediği sürece pH düşer. Bu miktar "B" çözeltisinin (Na2HPO4) üzerine 100 mL'ye 13 . çok kolay ve dolayısıyla çok yaygın olarak kullanılan bir faktördür.09. # Çizelge 01'de 4. # 03. # Tampon (buffer) olarak en çok kullanılan maddeler. # Bir besiyerinde elden geldiğince çok sayıda mikroorganizma geliştirilmesi isteniyorsa pH nötre yakın değerde olmalıdır.04.067 M Na2HPO4 (11. Na2HPO4. # Büyük ölçekli endüstriyel üretimlerde pH stabilitesi tampon eklenerek değil. Bazı mikroorganizmalar alkali pH'ları yeğlerken (örneğin Rhizobium bakterileri).067 M KH2PO4 (9. asidofilik bakteriler) asidik ortamları severler. # Metabolizmaya bağlı olarak besiyeri pH'sında değişmeler meydana gelir. KH2PO4.
besiyeri bileşimine girenler sınırlıdır.60 88.80 0.3. "B" çözeltisi üzerine "A" çözeltisi ekleme işleminin pH metre kontrolü ile yapılması önerilir.0 / sarı Rosalic acid 6.00 96.30 2.8 8. # 14 .4 6.1 6.70 6.2 / sarı Neutral red 6.6 4.90 0.30 5.20 6.tamamlayacak şekilde 90.50 85.8 / sarı 8.90'a tamponlanmış olur.9 / mavi Fenol red 6.0 / sarı 7.04.50 31.6 / kırmızı 8.3 / mavi Metil red 4.10 67.00 12.2 * : Kaynak: www.35 5.90 6.04. Tampon çözelti hazırlamak için "B" çözeltisinden alınacak miktar (mL) pH "B" pH "B" pH "B" pH "B" pH "B" pH "B" 4. # 03.2 7.95 5.2 / sarı 8.35 5.60 4. Hazırlanan tampon çözeltisinin güvenilir olması için. İndikatör.80 93.90 95. Redoks İndikatörleri # En yaygın olarak kullanılan redoks indikatörü TTC (2. Ayrıca besiyerinde stabilite. # 03.40 3.10 15.4 / kırmızı 6.60 37.80 7.8 / kırmızı Litmus 5.00 6.8 / sarı 8.90 9.2 / kırmızı # Bunlara ek olarak kimyasal analizlerde kullanılan pek çok pH indikatörü bulunmakla birlikte.12.2 7.00 0. besiyeri bileşimlerinde yaygın olarak kullanılan pH indikatörleri ve pH'ya bağlı renkler verilmiştir.7 7. # Çizelge 02.4 / kırmızı Bromocresol green 3. su yerine bu çözelti kullanıldığında besiyeri pH'sı 5.6 / mavi Cresol red 7. özellikleri de olmalıdır.11.80 49.3 / menekşe Bromothymol blue 6.30 77.1 7.10 1.0 7. öncelikle geliştirilmesi istenen mikroorganizmaya zarar vermemelidir.6 7. # Çizelge 01.40 26.0 6.60 5.90 6. pH'daki değişme en kolay olarak pH indikatörleri ile belirlenir ve bunların renk değişimine bağlı reaksiyonlar o besiyerinde gelişen mikroorganizmalar için önemli göstergeler olur.4 7. hedef pH'larda kesin renk dönüşümü vb.5 Triphenyl-tetrazolium chloride)'dir.80 5.80 6.3 7. Enterokokların selektif geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılır ve buna bağlı olarak besiyeri bileşimlerinde yer alır.20 18.0 / sarı 4.20 72.40 81.8 / kırmızı 8.2 / sarı 6.00 61.20 1. 2. pH İndikatörleri ve Renk Değişim Sınırları İndikatör Asit pH / renk Alkali pH / renk Fenol blue 3.5 5.2 5.2 7.org Bu çizelge. # Aşağıda.5 5.70 43.4 / mavi Bromocresol purple 5.1 6. Besiyeri bileşimine giren maddeler tartılır. pH İndikatörleri # Mikrobiyel metabolizma sonunda bazı besiyeri bileşenlerinden çeşitli asit veya alkali ürünler meydana gelir.9 5.20 mL "A" çözeltisi (KH2PO4) eklenir.0 7.90 55.kimyaevi.50 3.30 22.8 / sarı 5. desimali de gösteren şekilde bu sitede vardır.70 91.90 6.
Gıda mikrobiyolojisinde Listeria tanımlanmasında yaygın olarak kullanılır. #-Lesitin: Yumurta sarısı ve soya fasulyesinde bulunan lesitin. Gıda mikrobiyolojisinde Staphylococcus aureus ve Bacillus cereus besiyerlerinin bileşiminde yer alır. çeşitli bakterilerdeki lesitinaz enzim aktivitesi sonunda parçalanır ve lesitin katılmış katı besiyerinde koloni etrafında berrak zonlar görülür. Bölümde ayrıntılı bilgi verilmiştir. ve kan hakkında bilgi 40. Bölümde verilmiştir. Floresan ışıma. yaygın olarak kullanılan bir diğer redoks indikatörüdür.06. Hemoliz reaksiyonunun belirlenmesi için kullanılır. MUG hakkında 14. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl. #-Tributirin: Lipolitik aktivitenin belirlenmesi için kullanılır. 5-bromo-6-chloro-3-indolyl ya da 6-chloro-3indolyl gibi indolil türevleri olan kromojenik substratların kullanımı giderek daha fazla önem kazanmaktadır. coli tanımında son yıllarda en yaygın olarak kullanılan bir bileşiktir. # 03. #-Kromojenik substratlar: Katı besiyerinde şeker ve pH indikatörüne bağlı selektif izolasyon sistemi yerine. Kazein kullanılan yöntemde ise proteolitik bakteri kolonileri etrafında proteolize bağlı olarak berrak zonlar meydana gelir.04.05. # # # 15 . #-Jelatin ve kazein: Bunlar. bu besiyerlerinde gelişen mikroorganizmaların ön identifikasyonunda kullanılır. #-Kan: Aksine bir uyarı yoksa besiyeri bileşimine giren "defibrine koyun kanı"dır.Enterokoklar TTC'yi indirgeyerek kırmızı renkli bir bileşiğe (formazon) dönüştürür. Çiğ sütlerde metabolizmaya dayalı bir sayım yönteminde kullanılmasına karşın. oksijen varlığında sıvı besiyerinin ya da katı besiyerindeki koloninin renk değiştirmesidir. Jelatin kullanılan yöntemde inkübasyon sonrası soğutulan besiyerinin katılaşmaması jelatinin hidrolize edildiğini gösterir. #-MUP (Methylumbelliferyl-phosphate): Cl. # Resazurin. Hemoliz reaksiyonları 37. # #-MUG (4-Methylumbelliferyl-ß-Glucuronide): E. Bu şekilde besiyerinde oluşan kırmızı renkli kolonilerin enterokok olduğu anlaşılır. kromojenik substratın hedef bakteri ya da bakteri grubu için özgün olan enzim ile şeker ve kromojene parçalanması. loş bir ortamda belirgin bir şekilde görülür. Diğer İndikatörler # Mikrobiyel metabolizmaya bağlı olarak bazı kimyasalların çeşitli reaksiyonlar sonucu oluşturdukları belirli ürünlerin saptanması. Lipolitik bakteri kolonileri etrafında lipoliz sonunda berrak zonlar oluşur. Bu tip reaksiyonlarda kullanılan indikatör örnekleri aşağıda verilmiştir. Bölümde ayrıntılı bilgi verilmiştir. doğrudan koloni rengi değişir ve bu değişim pH'dan etkilenmez. Bu sistemin prensibi. Klasik pH indikatöründen farklı olarak bu sistemde koloni etrafında zon oluşmaz. sütte antibiyotik ya da gelişmeyi engelleyici bir madde bulunması halinde doğru sonuç alınamaz. E.13. Bu konuda 07.13. perfringens için karakteristik olan asit fosfataz enzimi MUP'u yine uzun dalga boylu UV ile floresan ışıma veren bir bileşiğe (methylumbelliferone) parçalar. proteolitik bakterilerin belirlenmesi amacıyla besiyeri bünyesine katılır. coli 'deki ß-D-Glucuronidase (MUGase) enzimi MUG'u uzun dalga boylu (366 nm) UV ile floresan ışıma veren bir bileşiğe (methylumbelliferone) parçalar.
# Besiyerlerinde inhibitör olarak kullanılan maddeler genel ve selektif inhibitörler olarak kabaca ikiye ayrılabilir. Cetrimide (cetyltrimethylammonium bromide) Pseudomonas aeruginosa dışında pek çok refakatçi florayı inhibe ettiği için Pseudomonas besiyerlerinin bileşiminde yer alır. Besiyerinde tek inhibitör yerine. Ox bile): Gram pozitif bakterilerin gelişimini engeller. Sadece belirli bir türün dışındaki tüm mikroorganizmaların gelişimini etkileyen inhibitör madde kullanımı oldukça enderdir. #-Safra tuzları (Bile salts. selektif inhibitörler belirli mikroorganizmaların gelişimini etkiler. Örneğin. bazı bakteriler için inhibitör etki yaparken. İnhibitör olarak kullanılan maddenin görevi. birden fazla inhibitör de kullanılabilir. Örneğin. kısmen koliformları ve zayıf olarak Shigella 'yı engeller. maya ve küflerin gelişimini inhibe eden bir etki gösterir. # İnhibitör olarak kullanılan tüm maddelerin hangi mikroorganizmalar için hangi konsantrasyonda ve hangi mekanizma ile inhibisyon etki sağladığını listelemek çok güçtür ve bu kitabın konu kapsamı dışındadır. pek çok besiyerine ozmotik basınç sağlamak için katılan NaCl. gelişmesi istenen mikroorganizma için inhibitör etki yapmaması gerekir. İnhibitörler # Selektif besiyeri bileşimlerinde. bu bakteri ile ilgili çalışmalarda besiyeri bileşimine katılır. coli O157:H7 serotipi diğer E. Örneğin. # İnhibitör etki. sonuçta gri–siyah renkli koloni oluşumu stafilokok ve mikrokoklar için tipik bir morfolojik göstergedir. yüksek konsantrasyonlarda pek çok mikroorganizmanın gelişimini engeller. #-Deoksiçolat (Deoxycholate): Gram pozitif bakterileri. İnhibitör maddelerin etki şekilleri çok farklıdır ve güçleri konsantrasyonlarına bağlıdır. diğer tüm bakteri. Mikroorganizma için C kaynağı olarak kullanılan glikoz. 16 . Bunun dışında mikroorganizma cinsi ve hatta türü ile serotipi inhibisyonda önemlidir. Örneğin. Salmonella besiyerlerinin çoğunda bulunur.03. E. yukarıda belirtildiği gibi öncelikle konsantrasyona bağlıdır. #-Antibiyotikler: Genellikle bakterileri engellemek için geniş spektrumlu olarak küf geliştirme besiyerlerinde ya da refakatçi bakteriyel florayı inhibe etmek için dar spektrumlu olarak kullanılırlar. en çok kullanılan inhibitörler hakkında aşağıda kısaca bilgi verilmiştir: #-Boyalar: Metakrom sarısı (metachrome yellow) Proteus kolonilerinin yayılmasını.04. Genel inhibitörler daha geniş bir spektrumda istenmeyen mikroorganizmaların gelişimini engellerken. %50 konsantrasyonda ozmofilik/ozmotolerant mayaların gelişimine izin verirken. Belirli bir madde (örneğin tellurit). istenmeyen mikroorganizmaların gelişimini baskılayan çeşitli inhibitör maddeler kullanılır. #-Sodyum azid: Gram negatif bakterilerin gelişimini engeller.14. malahit yeşili Pseudomonas aeruginosa dışındaki pek çok refakatçi floranın gelişimini baskılar. bazı bakteriler telluriti metalik tellura indirger. coli O157:H7 serotipi ile ilgili çalışmalarda sefiksim yaygın olarak kullanılır. istenmeyen mikroorganizmaların gelişmesini önlemek iken. Bununla beraber. Benzer şekilde E. coli 'ler ve refakatçi floraya oranla sefiksim–tellurit kombinasyonuna kayda değer ölçüde direnç gösterir. Bacillus cereus refakatçi floraya göre Polimiksin B sülfattan daha az etkilendiği için. eosin Y ve metilen mavisi (methylen blue) Gram pozitif bakterilerin gelişimini. # Bir yaklaşıma göre her maddenin yüksek konsantrasyonlarda inhibisyon etkisi vardır.
17 . #-Anorganikler: Mikroorganizmalar beslenme için çeşitli anorganik maddelere de gerek duyar. Bunlardan bazıları aşağıda kısaca özetlenmiştir: #-İnaktivatörler: Lesitin.Ayrıca.15. Kimi araştırıcı ve kullanıcıya göre belirli bir grupta yer alan bir besiyeri. arjinin. Bunlara en tipik örnek azot kaynağı olarak nitrat (NO3) kullanılmasıdır. "Kanlı Agar" besiyeri bu konuda tipik bir örnek verilmiştir. lauryl sülfat.çeşitli besin maddelerinin bileşiminde yeterli miktarlarda bulunmakla birlikte. Tween 80 ve çeşitli elementler ilk akla gelenlerdir. #-İndirgeyiciler: Anaerobik ortam oluşturmak için çeşitli maddeler kullanılır. KCN. Üre. türev.04. Besiyeri Çeşitleri # Besiyerleri. tetratiyonat. bu maddeler bazı besiyerlerine mikrobiyel gelişmenin sağlanması için katılmaktadır. deniz balıklarındaki bakteriler için deniz suyu besiyeri bileşiminde yer alır. Bunlar arasında vitaminler.05. yüksek konsantrasyonda asetat vb. #-Özel besin maddeleri: Besiyerleri içinde gelişmesi istenen mikroorganizmanın kullanabileceği. maddeler çeşitli besiyerlerinde inhibitör madde olarak kullanılır. Tween 20. # 03. Çeşitli makro ve iz (mikro) elementler -başta peptonlar ve ekstraktlar olmak üzere. Bunlar arasında ilk akla gelen thioglycollate'tır. ornithin vb. # Besiyerlerinin kullanım amacına göre sınıflandırılması ise bir anlamda besiyeri bileşimleri ile doğrudan ilgilidir ve sınıflandırmada en yaygın olarak kullanılan uygulamadır. #-İdentifikasyon amacıyla kullanılan bileşikler: Yukarıda ilgili bölümlerde identifikasyon amacıyla çeşitli kimyasalların besiyerleri bünyesinde yer aldığına değinilmiştir. fiziksel özelliklerine göre sıvı ve katı olmak üzere iki gruba ayrılırken. #-Stimülatörler (Gelişmeyi teşvik ediciler): Analiz edilen örnekte gelişmesi istenen mikroorganizmayı teşvik etmek amacıyla besiyeri bileşimine çeşitli maddeler katılabilir. Kullanım amacına göre sınıflandırılmalarında da farklı yaklaşımlar vardır. birbirinden farklı mantıklar altında gruplandırılabilir. sütte bulunan bakteriler için süt tozu. çeşitli aminoasitler (lisin. piruvat. Bunların dışında pek çok kimyasal madde çeşitli fizyolojik ve biyokimyasal testlerde kullanılmak üzere besiyerlerinin bünyesinde yer almaktadır. şekillerde de sınıflandırılabilirler. karışık vb. ara ürün ve son ürünlerindeki çeşitli antimikrobiyel maddeleri inaktive ederek bu gibi ürünlerde bulunması olası mikroorganizmaların belirlenmesini sağlarlar. Tween 80 gibi maddeler başta ilaç ve kozmetik endüstrisinde ham madde. Örneğin. glisin. bir diğerlerine göre başka bir grupta sınıflandırılmaktadır. bizmut. hayvansal. Özel besin maddeleri olarak nişasta ve glutamat da kullanabilir. selenit. Örneğin besiyerleri. sentetik. #-Doğal ortam oluşturanlar: Bazı bakterilerin gelişmesini teşvik etmek için onların doğal olarak bulundukları ortamlar besiyerine katılır. sistein. Aşağıda. diğerleri için besin maddesi olarak yararlanılamayacak çeşitli maddeler yer alabilir.) identifikasyon amacı ile besiyeri bileşimine giren maddelerin tipik örnekleridir. Diğer Maddeler # Besiyerlerine çeşitli amaçlarla katılan ve yukarıdaki gruplara girmeyen daha pek çok madde vardır. bir başka bakış açısı ile kaynağına göre bitkisel. # # 03.
kullanım amacına göre en çok kabul gören sınıflandırma şekline göre gruplandırılmıştır. termofillerin. CASO (Tryptic Soy) Agar ve CASO (Tryptic Soy) Broth en sık kullanılan genel besiyerleri içinde yer alırlar. Burada amaç. #-Günlük kullanımdaki bakterilerin aktifleştirilmesi. coli fajları ile ilgili bir çalışmada genel nitelikli bir besiyeri kullanılabilir. besin maddelerince yeterli veya zengin. #-Nedeni hakkında bir ön fikir edinilemeyen bozulma ya da hastalık etmeninin izolasyonu için de genel besiyeri kullanılır. bazı zor gelişenlerin de dahil olduğu çok sayıda mikroorganizmanın gelişmesini sağlayan besiyerleridir. # Bir yaklaşıma göre genel besiyerleri dışında kalan tüm besiyerleri "özel besiyerleri" grubuna girer. Bununla beraber. # Genel besiyerleri başlıca toplam mezofil aerob bakteri sayımı. Plate Count Agar. inkübasyon koşullarının değiştirilmesi ile psikrofillerin. # Bu grupta değerlendirilen besiyerleri genel olarak bakteriler için kullanılır. Klinik mikrobiyolojide farklı gruplardaki zor gelişen bakteriler için genel besiyerlerine başta kan olmak üzere katkılar ilave edilerek zenginleştirmeler yapılmaktadır. Nutrient Agar ve Nutrient Broth. # 03. Özel besiyerleri ise kendi içinde farklı alt gruplar altında değerlendirilir.05. zor gelişen bir mikroorganizma olabileceği varsayımı ile bu tip izolasyonlarda bunların gelişebileceği zenginleştirilmiş besiyerleri kullanmak daha doğru olur. toplam psikrofil aerob bakteri sayımı. bu besiyerlerinde maya ve küfler de gelişebilir.01. Etmenin. # Gıda mikrobiyolojisi açısından ele alındığında. # Genel besiyerleri. basit olarak korunması vb. Gıda mikrobiyolojisinde bu tip uygulamalara genellikle gerek duyulmaz. Genel besiyerleri zor gelişen bakterilerin sadece bir bölümünün gelişmesini sağlayabilir. Benzer şekilde E. herhangi bir mikroorganizma grubunun gelişmesini özel olarak desteklemeyen. Genel Besiyerleri # Herhangi bir inhibitör madde içermeyen. Bu sınıflama şeklinde besiyerleri öncelikle "genel besiyerleri" ve "özel besiyerleri" olarak iki ana gruba ayrılmaktadır. # 18 . Buna göre. Tüm bakterilerin geliştirilebileceği nitelikte bir besiyeri yoktur. bozulma ya da hastalık etmeninin ön izolasyonu gibi amaçlar için kullanılır. aerotolerantların ve özel inkübasyon koşullarının sağlanması ile kısmen anaerobların geliştirilmesinde de kullanılır. amaçlarla da genel besiyerleri yaygın olarak kullanılır. #-Başta gıda maddeleri olmak üzere pek çok örnekte "toplam mezofil aerob bakteri sayısı" ile "toplam psikrofil aerob bakteri sayısı" tayinleri önemli kalite kriterleridir. mikroaerofillerin. Toplam mezofil aerob bakteri sayısından kasıt 28–30 oC'da (kimi kaynaklara ve amaca göre 35–37 oC'da) gelişebilen aerob bakterilerin sayısıdır.Bu kitapta besiyerleri. etmenin her ne olursa olsun öncelikle izole edilmesidir ve genel bir besiyeri kullanmak bir anlamda zorunludur.
gıda sanayisinde Pseudomonas aranması için kullanılan GSP Agar besiyerinde glutamat ve nişastadan başka besin maddesi yoktur. Bir besiyerine selektivite kazandırılması sadece inhibitör madde ilavesi ile yapılmaz. Geliştirilmesi istenilen mikroorganizmanın kullanabileceği. Bu amaçla genellikle çeşitli inhibitör maddeler kullanılır. Brain–Heart (Infusion) Broth ve Brain–Heart Agar ile Tamponlanmış Peptonlu Su da genel besiyeri olarak değerlendirilir. # Bununla birlikte. # Nişasta ve glutamat Pseudomonas ve Aeromonas türleri tarafından besin maddesi olarak kullanılırken. Bir klinik örnekten sadece ß hemoliz yapan bakterilerin izolasyonu için kullanılıyorsa bu kez diferansiyel besiyeri olarak değerlendirilir. selektif sayım ve hatta ön identifikasyon amaçları ile kullanılabilir. # Yüksek selektivite gösteren besiyerleri. # Kanlı agar üzerinde bir diğer yaklaşım. Bu gibi örnekler. # Ozmofil mayalar ve halofil bakterilerin analizi için geliştirilen besiyerleri bunların tipik örnekleridir. basit bileşimli bir genel besiyerine kan ilavesi ile hazırlanır. inhibitörlerin gelişmesi istenen mikroorganizmaya az da olsa bir miktar zarar verebilmesi.Ayrıca. # Mikrobiyolojide besiyeri olarak selektif ortamlar yerine diferansiyel besiyerlerinin hazırlanması ve kullanılması ile çoğu kez tatmin edici sonuçlar alınmaktadır. # İnhibitörlerin konsantrasyonu ile baskılanması hedeflenen mikroorganizmaların cins ve türlerine göre değişmek üzere. klinik mikrobiyolojide standart genel besiyerlerinde gelişemeyen "zor gelişen" bakterilerin izolasyonu için kullanıldığında "zenginleştirilmiş genel besiyeri" olarak değerlendirilir. atık sular ve gıda endüstrisi ekipmanında bu bakteriler ile birlikte bulunan refakatçi mikroflora bu maddeleri metabolize edemediği için gelişemez. orta veya yüksek selektivite gösterir.05. nedenlerle her zaman istenilen sonucu vermemektedir. sadece bir tür mikroorganizmanın gelişebileceği selektivitede besiyeri örneği çok azdır. Bu maddeleri çok kısıtlı olarak kullanabilenler ihmal edilebilecek kadar küçük koloni oluştururlar. ancak gelişmesi istenenler için -tersine olarak. inhibitör kullanımı ile refakatçi flora inhibisyonun her zaman mümkün olmaması. Örneğin. tek cins ya da türde mikroorganizma gelişmesine izin vereceğinden bu besiyerleri selektif izolasyon. Kanlı agar. ancak refakatçi mikroflora tarafından kullanılamayan besin maddeleri besiyerine karbon ve azot kaynağı olarak verilerek de selektivite sağlanabilir. gıda maddeleri.minimum düzeyde olumsuz etki yapmak üzere formülize edilir. selektif besiyerleri bunlar için zayıf. 19 . # Selektif besiyeri hazırlamak ve kullanmak. Cetrimide Agar ise oldukça ender örneklerden birisidir. gelişmesi istenen mikroorganizmanın belirli bir inhibitöre aşırı direnç göstermesi ile ilgilidir. Selektif Besiyerleri # Selektif besiyerleri. besiyerlerinin kullanım amacına göre farklı gruplarda değerlendirebileceğini gösterir. # 03. Kanlı Agar ise. Gıda mikrobiyolojisinde elde edilen bir izolatın hemoliz reaksiyonunun belirlenmesi amacı ile kullanıldığında ise identifikasyon besiyeridir.02. karışık bir mikrobiyel floradan gelişmesi istenmeyenleri olabildiğince fazla baskılamak. bazı inhibitörlerin insan sağlığına zararlı olması vb.
Diferansiyel besiyerinde gelişen mikroorganizmaların ayrımı koloni morfolojisi. sayısını artırmak. 03. sıvı besiyerinde sadece hedef mikroorganizmanın var/yok olduğu anlaşılır. koliform grup bakteriler için laktozdan gaz oluşturulması tipik bir ayırt edici özelliktir ve gaz oluşumu Durham tüpleri kullanılarak belirlenir.03. Bölüm). Bu tanımlamaya göre diferansiyel besiyerleri. Ayrıca mikroorganizmanın jelatinaz.03. Fark Ettirici) Besiyerleri # Diferansiyel besiyerlerinde gelişmesi istenen mikroorganizma yanında diğer mikroorganizmalar da gelişebilir. selektif sayım ve ön identifikasyon amaçları ile kullanılmaktadır. # Hemoliz reaksiyonları için kullanılan kanlı agar besiyeri bunun en tipik örneğidir. çıplak gözle yapılabileceği gibi. çeşitli pH indikatörleri. amaçlarla kullanılan zenginleştirme besiyerleri. lipaz. boya maddeleri. # Ayırt edici koloni özelliği.03. Ancak başta koloni morfolojisi olmak üzere çeşitli farklılıklar ile hedef mikroorganizma diğerlerinden ayrılır. enzimatik aktivitelerin belirlenmesi. gaz oluşumunun izlenmesi vb. # Diferansiyel besiyerleri sadece selektif besiyerlerinin bir modifikasyonu değildir. amaca göre selektif izolasyon. Çeşitli genel besiyerlerine ilave edilen özel bazı katkılar bu besiyerlerine diferansiyel bir nitelik kazandırabilir. lesitinaz vb.04. Zenginleştirme Besiyerleri # Karışık bir mikroflora içinde hedeflenen bir mikroorganizmayı geliştirmek. Ancak. # Ön zenginleştirme besiyerleri genel olarak hasar görmüş (yaralanmış. fekal koliform bakteriler yanında E. # 03. Katılardan koloni izolasyonu mümkündür ancak. dolayısı ile aktivite kazanması istenen mikroorganizma yanında refakatçi mikrofloranın da gelişmesini sağlayan sıvı besiyerleridir. indirgeyiciler. EC Broth'a MUG ilave edilerek hazırlanan bir besiyerinde.05. ön zenginleştirme besiyerleri ve selektif zenginleştirme besiyerleri olarak 2 alt gruba ayrılır.05. diğer bazı bakteriler besiyerinde gaz oluşturmadan gelişebilir (bakınız. # Diferansiyel besiyerleri. Gaz görülen tüpte koliform grup bakteri olduğu kesindir. coli analizi de floresan testi ile yapılabilir. bileşiminde inhibitör içermeyen. floresansa dayalı olarak kolayca yapılabilmektedir. hücrede olası hasarların giderilmesini sağlamak vb. # Örneğin. Diferansiyel (Ayırt Edici. maddelerin besiyerine ilavesi ile yapılır. enzim aktiviteleri besiyerinde oluşan berrak zonlar ile belirlenebilir.04. diğer indikatörler vb. # Bu besiyerleri sıvı ya da katı olabilir. stres altında) mikroorganizmaların aktivitelerini kazanmaları için kullanılan. zayıf ve orta güçte selektivite gösteren selektif besiyerlerinin modifikasyonu olarak nitelendirilebilir. # 20 . Buna göre "özel amaçla kullanılan genel besiyerleri" olarak da nitelendirilebilirler. Pek çok mikroorganizma belirli bir karbohidratı kullanırken asit oluşturur ve bu asitlik pH indikatörü ile kolayca belirlenebilir.
Bu besiyerlerine en tipik örnek. İdentifikasyon Besiyerleri # Selektif ve diferansiyel besiyerlerinin ön identifikasyonda kullanılabileceğine yukarıda değinilmiştir. çeşitli selektif inhibitörlerin kullanımı ile kısmen ya da tümüyle engellenir. gıdalarda Salmonella aranmasına yönelik çalışmaların ilk aşaması olan ön zenginleştirmede kullanılan "Tamponlanmış Peptonlu Su" besiyeridir. laktoz ve sakkarozdan asit 21 . Yatık agar olarak tüplerde hazırlanan bu besiyerinde tek ekim ile glikoz. # Bir mikroorganizma izolatının tanımlanması için halen en çok kullanılan testler biyokimyasal nitelikli olanlardır. coli olarak değerlendirilir. coli O157:H7 analizi doğrudan selektif zenginleştirme ile başlarken.05. Yarı katı olarak Nutrient Agar gibi genel besiyeri ya da SIM Medium gibi kombine bir besiyeri kullanılabilir. # Klinik mikrobiyolojide ise Salmonella kuşkusu duyulan dışkı örneği selektif zenginleştirme aşamasına alınmakta. # Selektif zenginleştirme besiyerleri ise özel amaçla kullanılan selektif sıvı besiyerleridir. # Tam selektif bir besiyerinde gelişen bir mikroorganizmanın identifikasyonu cins ve hatta tür bazında tamamlanabilir. triptofandan indol) oluşturup oluşturmadığının belirlenmesi vb. Bunun en tipik örneği Salmonella analizinde yaygın olarak Triple Sugar Iron Agardır. hatta gerekirse bu aşama bile geçilip. # Selektif zenginleştirme aşaması. # Selektif zenginleştirme aşamasında karışık kültür olarak bulunan bakterilerden gelişmesi istenmeyenler. dışkıda aktif ve yüksek sayıda Salmonella varsa bunu zenginleştirmeye gerek yoktur. Diğer bir deyişle. Diferansiyel besiyerlerinde de aynı durum geçerlidir. amaçlar ile kullanılır. Bileşimi 10 g/L et peptonu. E. belirli bir besin maddesinden metabolizma sonunda tayin edilebilecek metabolitleri (örneğin. selektif katı besiyerine sürme yapılmaktadır. MUG içeren bir selektif katı besiyerinde floresan veren koloni E.05. tüm zenginleştirme aşamalarının bağırsakta bitmiş olmasıdır. # Selektif zenginleştirme aşamasını genellikle selektif bir katı besiyerine sürme yapılarak aranan bakterinin selektif izolasyonu aşaması izler. # Bir besiyerinde birden çok mikrobiyolojik tanımlama testi aynı anda beraberce yapılabilir. 5 g/L NaCl ve 10 g/L fosfat tampon olan bu besiyerinde Salmonella yanında ortamdaki diğer bakteriler de kolaylıkla ve iyi bir şekilde gelişebilir. her zaman ön zenginleştirme aşamasını izlemez. mikroorganizmanın belirli bir besin maddesini (örneğin. Hedef bakteri ve analiz edilecek örneğe göre doğrudan selektif zenginleştirme ile de analize başlanabilir. Bakterinin hareketli olup olmadığının saptanması amacıyla kullanılan yarı katı besiyerleri de bu gruba dahil edilmektedir. Listeria analizinde ise yarı selektif zenginleştirme ve selektif zenginleştirme şeklinde bir uygulama vardır. Bunlara en tipik örnekler Listeria ve Salmonella aranmasında kullanılan besiyerleridir. Bu uygulamanın nedeni. İdentifikasyon besiyerleri. laktoz) kullanıp kullanmadığının saptanması. selektif izolasyonda başarı şansını artırmak için aranan bakterinin karışık kültür içindeki sayısını artırmaktır. Buna göre selektif zenginleştirmenin amacı. Örneğin. # 03.
besiyeri ambalajı üzerindeki bilgiler her zaman çok dikkatlice okunmalıdır. # Her besiyeri kutusunda. Fransızca. vitamin ve aminoasitlerin mikrobiyel yolla belirlenmesi. Bazı besiyerlerinin formülden hazırlanması gerektiği gibi. selektif besiyerlerinin bir kısmına sterilizasyon sonrasında çeşitli katkılar ilave edilir. Bu gibi nedenlerle aynı marka kullanılıyor olsa da. Diğerleri # Agar disk difüzyonu ile yapılan antimikrobiyel duyarlılık ve minimal inhibisyon konsantrasyonu testleri. üzerine damıtık su eklenir ve gerekli ise başka kaplara (örneğin tüplere) dağıtılıp. katalogunda ya da prospektüsünde. Bunların dışında istenilen formülde "sipariş üzerine" üretilen besiyerleri de vardır. dillerde de açıklamalar bulunur.06. Bu gibi identifikasyon amaçlı ve birden çok test uygulananlar "kombine besiyeri" olarak adlandırılır. sıvı. yapmayın 22 . # Aşağıda besiyeri kutularında ve kataloglarında geçen bazı İngilizce sözcük ve terimlerin Türkçe karşılıkları gösterilmiştir. # 03. Besiyerlerinin Hazırlanması # Laboratuvarlarda kullanılan pek çok besiyeri. Bu amaçla. # 03. Bunlar talebe göre dehidre. Çoğunda İngilizce'ye ek olarak Almanca. # Gerek kutu üzerinde yabancı dilde yazan hazırlama bilgileri gerek ilgili talimatlarda kuşkuya düşülür ise derhal bir üst yetkiliye danışılmalıdır. dehidre formdan hazırlanır. Besiyerlerinin bir kısmı otoklavda. # Endüstriyel üretimde kullanılan besiyerleri ise oldukça farklı bir gruptur. # Çizelge 03. bir kısmı sadece kaynatılarak sterilize edilir. saf kültürlerin korunması (koleksiyonu). taşınması gibi özel amaçlara yönelik olarak kullanılan çeşitli besiyerleri de vardır. o besiyerinin nasıl hazırlanması gerektiği son derece basit ve 40–50 sözcükle İngilizce olarak yazmaktadır. İtalyanca vb. kullanılan besiyerlerine göre değişmek üzere bunların hazırlanma şekillerinde kayda değer ölçüde farklar vardır. Hatta bazen aynı besiyerinin 2 farklı ticari markası arasında bile hazırlanma farkı görülebilmektedir. sterilize edilir.05. Bu kitabın 4.06. besiyeri formülüne ve dolayısı ile hazırlanış şekline de yansımaktadır. # Bir diğer deyiş ile. glikozdan gaz oluşturma ve H2S oluşturma testleri yapılmaktadır. şişede ya da Petri kutusuna dökülmüş şekilde hazırlanabilmektedir. gereken miktar dehidre besiyeri tartılıp. otoklavlayın Düşük sıcaklık ve sürede otoklavlayın Sakının. ISO gibi uluslararası bir kuruluşta yapılan talimat değişikliği. Besiyeri hazırlamada yaygın olarak kullanılan İngilizce sözcük ve terimlerin Türkçe karşılıkları İNGİLİZCE About Add Autoclave Autoclave under mild conditions Avoid TÜRKÇE Yaklaşık İlave edin Otoklav.oluşturma. ana bölümünde gıda mikrobiyolojisini ilgilendiren besiyerlerinin büyük çoğunluğunun hazırlama şekilleri ayrıntılı olarak verilmiştir.
. saf) su Dağıtın Eritin Damıtık su . yeniden eritin 23 . Yapmayın (Besiyerini) otoklavda sterilize etmeyin (Besiyerini) fazla ısıtmayın (Besiyerini) tekrar ısıtmayın. water Dispense Dissolve Distilled water DO NOT .İNGİLİZCE Below Blue Boil Briefly Brown Caution Clear Completely Cool Dark Demin. hemen Kullanımdan hemen önce Sıvılaştırma. tümüyle Soğutun Koyu Deiyonize (damıtık. fazla Soluk. DO NOT AUTOCLAVE DO NOT OVER HEAT DO NOT REHEAT Filter–sterilize Filter–sterilized Flask Frequent stirring Freshly Gently Green Greenish Heat If Immediately Just before use Liquefy Medium Melt Min(ute) Mix Necessary Over Pale Plate(s) Pour Prepared Prior Red Reddish Refrigerator Reheat Reliquefy TÜRKÇE Altında.. hafifçe Kahverengi Uyarı. ısıtmak Eğer Derhal.. daha düşük Mavi Kaynatın Yavaşça. dikkat Berrak Komple. yeniden ısıtın Yeniden eritmek. hafifçe Yeşil Yeşilimsi Isıtın. eritin Dakika Karıştırın Gerekli Üzerinde.. yeni hazırlanmış Yavaşça. eritme. eritin Besiyeri Eritmek. eritmeyin Filtre ile sterilize edin Filtre ile sterilize edilmiş Erlen Sürekli çalkalayarak Taze. mat Petri kutusu (kutuları) (Petri kutularına) Dökün Hazırlanmış Öncesinde Kırmızı Kırmızımsı Buzdolabı Yeniden ısıtmak.
otoklavda ve etüvde (kuru hava sterilizatörü) sterilizasyona dayanıklı olması gereklidir. Cam kapların hacmi mutlaka yeterli bir karıştırma sağlanacak ölçüde olmalıdır. otoklav sonrasında da rahat ve güvenilir çalışma sağlamasıdır. 1 litrelik bir erlende 1 litre besiyeri hazırlanırsa soğuk noktanın yeri nedeni ile ya soğuk nokta yeterince sterilize edilemeyecektir ya da çepere yakın yerler gereğinden fazla ısıya maruz kalmış olacaktır. # Cam kabın büyük tutulmasının nedeni otoklavlama sırasında ısı geçişinin daha sağlıklı olması. hazırlanacak besiyeri hacminin yaklaşık 2 katı hacimde cam kap kullanılmalıdır. Kırık ve çatlak cam malzeme kullanılmamalıdır. kuvvetlice Su İyice Beyaz Sarı Sarımsı *Kaynak: www. Büyük miktarlardaki besiyerlerinin balonda hazırlanması aynı nedenle benimsenmez.06. eritin Yayılıcı Çalkalayın Kalın tabaka İnce tabaka Düzgün (tam) bir şekilde Tüp(ler) Küçük şişe Sertçe. ancak çok önemli bir ayrıntıdır.İNGİLİZCE Room temperature Selective supplement Semi solid Shake Slant (agar) Steam Store Suitable Supplement Suspend Swarming Swirl Thick layer Thin layer Thoroughly Tube(s) Vial Vigorously Water Well White Yellow Yellowish TÜRKÇE Oda sıcaklığı Selektif katkı Yarı katı Sallamak. karıştırın Yatık (agar) Buhar Saklayın (depolayın) Uygun Katkı Çözün. # Besiyerleri hazırlamak amacıyla kullanılan her türlü cam malzemenin yüksek kalitede ve düşük alkaliborosilikat özellikte. # İdeal olarak. Besiyerinin hazırlanacağı cam malzemenin yeterli büyüklükte olması çoğu kere ihmal edilen. karıştırmak. besiyeri hacmi cam kap hacminin en fazla 3/4'ü olabilir. Sıvı besiyerleri için.01.org # 03. Cam Malzeme # Besiyeri hazırlamada kullanılacak cam malzemenin çok iyi bir şekilde yıkanmış ve durulanmış.mikrobiyoloji. # 24 . besiyeri hazırlamada kullanılan kalitede sudan geçirilmiş ve yeterince kurutulmuş olması gerekmektedir. sallayın.
besiyerinin hazırlanış şekli ile doğrudan ilgilidir.1 gram duyarlılıktaki terazi kullanımı yeterlidir. Bu nedenle tartım sonrasında terazi üzerinde toz oluşmuş ise yumuşak fırça ile temizlenmeli ve damıtık su ya da %70 etil alkol ile silinmelidir. # Suyun yaklaşık 1/3'ü uygun bir kaba aktarılır. Bu uygulama ile cam kabın tabanına dehidre besiyerinin yapışarak erimemesine bağlı sterilizasyon yetersizliğinin önüne geçilir. Tartım sırasında besiyeri ve/veya bileşenlerinin çıplak deriye ve özelikle göze temas etmemesi sağlanmalıdır. Eğer bu temas varsa bol su ile ivedilikle yıkanması gerekir. # 25 . Bazı besiyerleri ise "Broth" formunda olsalar bile eritilmeleri için mutlaka ısıtılmalarına gerek vardır. sakkaroz gibi günlük hayatta sürekli iç içe olunan maddelerin de dahil edilmesi. bazı besiyeri bileşenlerinin toksik olduğu göz ardı edilmemelidir. Özellikle bileşimden hazırlanarak çok düşük miktarda tartım yapılacak ise. önce agarın erimesini sağlayacak şekilde ısıtılmalı. # Eğer besiyeri sıvı ise. terazide fark edilemeyecek arızalara neden olur ve bunun sonucunda hatalı tartımlar yapılır. Bir diğer deyiş ile 100 mL su ölçmek için 1 litrelik silindir kullanılmamalıdır. Bunun dışında. # Tartım için özel tartım kayıkçıkları ya da küçük beherler kullanılmalı. Bileşimden giderek az miktarda hazırlanan besiyerlerinde bu duyarlılık yeterli olmaz ise seyreltme tekniği uygulanabilir ya da daha duyarlı bir terazi kullanılabilir. # Besiyerine ilave edilecek su ayrı bir ölçü silindirinde bulundurulmalıdır. # Daha sonra suyun geri kalan kısmı cam kap boğazında ve iç çeperlerde kalmış olabilen besiyeri parçacıklarını yıkayarak kaba ilave edilir. # Bazı besiyerleri soğuk suda kendi halinde 5–10 dakika bırakılıp elle hafifçe bir çalkalama sonunda tümüyle eriyebilir. iyice karıştırılıp sonra otoklavlanmalıdır. doğrudan erlen ya da balona tartımdan olabildiğince kaçınılmalıdır. Bu tip ayrıntılara NaCl. eğer toz bulutu oluştu ise kesinlikle solunulmamalıdır. laboratuvar disiplini açısından son derece önemlidir. Prensip olarak suyun hacmi ile silindirin hacmi birbirine yakın olmalıdır. dehidre besiyerlerinin hepsinin higroskopik olduğu.03.06. Genel olarak günlük kullanımda 0. solunulması halinde solunum sisteminde zamanla hastalıklara neden olabileceği. Özellikle bileşimden hazırlamalarda tartım sırasında her madde için temiz spatül (kaşık) kullanılması. besiyeri ve/veya besiyeri bileşenlerinin kapakları açıldıktan sonra hata yapmamaya özen gösterilerek tartımın elden geldiğince çabuk bitirilmesi ve besiyeri kapağının sıkıca kapatılması gerekir. Tartım sırasında besiyeri ve/veya bileşenlerinin çok az da olsa toz bulutu oluşturmamasına özen gösterilmeli. bunun üzerine tartılmış dehidre besiyeri ilave edilir.02. terazinin kalibrasyonuna özellikle önem verilmelidir. dehidre besiyeri ya da besiyeri bileşenleri tümüyle eridikten sonra daha küçük cam kaplara dağıtılır ya da doğrudan sterilize edilebilir.Tartım ve Eritme # Tartımın yapılacağı terazinin duyarlılığı. # Tartım sonrasında oluşabilen toz bulutu terazinin iç parçalarına girerek. Agarlı besiyerleri hazırlandığı kapta otoklavlanacak olsa bile.
ısıtıcı tabla yaygın olarak kullanılır.Besiyeri bileşiminde agar varsa ve daha küçük hacimli kaplara dağıtılması gerekli ise besiyeri ısıtılıp. Erlen ya da balona önce 1 litre su doldurulur. Eritme amacıyla kullanılan ısıtıcı tablanın iş bitiminde kolaylıkla soğumadığı ve çeşitli laboratuvar kazalarına neden olduğu da unutulmamalı ve laboratuvar personeli bu konuda uyarılmalıdır. eğer pipet ağızla çekilirse ağızda önemli yanmalara neden olabileceği unutulmamalıdır. agarın eridiği anlamına gelmez. besiyeri hazırlamada "dehidre hazır besiyerinden 23 gram. # Otoklavlama öncesi ısıtarak eritme dikkatli yapılması gereken bir iştir. kaynar su banyosu. #-Erlen açık alevde ısıtılarak besiyeri eritme yoluna gidilmemelidir. besiyeri ya da besiyeri bileşenleri bu kapta -agar hariç olmak üzere. ancak bileşenlerin tam olarak eritilmiş olduğundan da emin olunmalıdır. Besiyeri hafifçe çalkalandığında erlen iç çeperinde partikül kalmaması erimenin tam olarak gerçekleştiğini gösterir. Bu amaç için tercihen "benmari" şeklindeki kaynar su banyoları kullanılmalıdır. Örneğin. #-Laboratuvarlarda genel olarak "sıcak su banyosu" bulunur. # Eritme sırasında erlenin ağzı alüminyum folyo ile hafifçe kapatılarak buharlaşma ve buharın laboratuvara dağılması önlenmelidir. endişe edilirse tekrar mikrodalga fırına konulmalı ve yeniden karıştırılmalıdır. 26 . 60 oC üzerindeki agarlı besiyerinin 25 mL'lik pipetle tüplere dağıtılması sırasında. Çoğunun ulaşacağı en yüksek sıcaklık 80 oC'dır ve buna bağlı olarak agarlı besiyeri eritilmesinde kullanılamazlar. Özellikle düşük miktarda agar içeren besiyerleri eritme sırasında aniden kaynayarak kaptan taşabilir. Sürekli karıştırılarak yapılmalıdır. Sonra tam eritme sağlanır. Bu nedenle mikrodalga fırın kullanılarak eritme yapıldığında. Aksi halde tam erimemiş partiküllerin yanmasına neden olunabilir. işaretli yere kadar damıtık su ilave edilir. cam yazar kalemle su düzeyi hassas bir şekilde işaretlenir. # Besiyerine ilave edilecek su miktarı çoğu kez hatalı ölçülür. agar tam olarak eritildikten sonra sürekli karıştırılarak 50–55 oC'da su banyosunda tutulurken dağıtılması gereklidir. suyun yarısından fazlası bir başka temiz kaba alınır. # Özellikle agarlı besiyerlerinin otoklav öncesinde agarın mutlaka tam olarak eritilmesi için farklı uygulamalar söz konusudur. #-Isıtıcı tabla kullanılıyorsa manyetik karıştırıcılı olanlar tercih edilmelidir. Aksi halde sürekli olarak elle karıştırılıp.bileşenlerin tam olarak eritilmesi amacıyla yapıldığı. ısının tüm besiyeri kütlesine eşit olarak dağıtılmış olması gerekir. Erleni rahatça içine alacak ve su kaynatmaya uygun herhangi bir kap bu amaçla kullanılabilir. #-Mikrodalga fırın ani ısınmalara ve kaynamalara neden olacağı için dikkatli kullanılması gerekir. bunlara dayanarak besiyerinin kaynatılmaması gerektiği unutulmamalı. 1 litre suda çözülür" şeklindeki bildirişin anlamı 23 gram dehidre besiyeri üzerine toplam 1 litre su ilave edilmesi demek değildir. Eritme işleminin -başta agar olmak üzere. Besiyerinin kaynadığının görülmesi. Manyetik karıştırıcıda kullanılan manyetin (balık) mikrodalga uygulaması sırasında erlenden çıkartılması önerilmektedir. erlen iç çeperinde agar ya da diğer besiyeri partiküllerinin kalmadığından emin olunmalı. Bunlar arasında mikrodalga fırın. kaynamadan sonra erlen tercihen manyetik karıştırıcı kullanılarak karıştırılmalı. günlük kullanılan besiyerlerinde en zor eriyen bileşenin agar olduğu ve 90 oC'da eridiği.eritilir. erlen dibinde kalabilecek erimemiş parçaların yapışmasına ve yanmasına neden olunmamalıdır. tartım yapılır.
# Potato Dextrose Agar. # Çeşitli bakterilerin tanımlama testleri içinde yer alan "belirli bir pH'da gelişebilme" gibi analizlerde besiyeri pH'sı tam olarak ayarlanmalıdır. Çünkü sterilizasyon sonrasında pH az da olsa değişir. 45 oC'a soğutulduğunda üzerine filtre ile sterilize edilmiş %10 tartarik asit çözeltisinden 14 mL/L olacak şekilde ilave edilir. pH kağıdı ile yapılan ölçümün çok duyarlı olmadığı. besiyerinin doğru hazırlanması ve sterilizasyonun sulandırmadan sonra vakit geçirmeden yapılması ile besiyeri pH'sında bir sorun çıkmaz. sterilizasyon sonu ve oda sıcaklığındaki (25 oC) pH'dır. pH'sı kontrol edilir. sterilizasyon sonrasında yanlış pH elde edilmesine yol açar. pH Ayarlama # İster ticari olarak hazırlanmış dehidre besiyeri hazırlama katalogları ve prospektüslerinde ister bilimsel çalışmalara yönelik literatür bilgisinde olsun. basit orantı ile asıl kaptaki besiyerine ilave edilecek asit ya da alkali miktarı hesaplanır. # pH ayarlaması için pH kağıdı da kullanılabilir. Bu uygulama standart besiyerlerinin hazırlanmasında ihmal edilebilecek bir ayrıntı iken. 27 . Bu işlem ile pH 5. # Aksine bir belirtme yoksa. pH metre kullanılıyor ise sıcaklık düzeltmesine dikkat edilmesi gereklidir. sonra orantı ile asıl besiyerine daha derişik (1 N) asit ya da baz ilave edilir.06. sadece "fikir vereceği" göz önünde tutulmalıdır. Dolayısı ile besiyeri pH'sının sterilizasyon öncesinde ayarlanması. aseptik koşullarda alınacak belirli bir hacimdeki besiyerinde titrasyon ile pH ayarlaması yapılır. BAT Agar örneklerinde olduğu gibi besiyeri çok asitli ise. Katı besiyerinde pH ölçüm ve ayarlama işleminin agarın jelleşme sıcaklığının üzerinde yapılması. sterilizasyon sonrasında asit ilave edilir. Günlük uygulamada talimatta gösterildiği şekilde asit ilavesinden sonra pH kontrolüne gerek yoktur." şeklinde bir açıklama getirmiştir. Az olan kısım dehidre besiyerinin hacmi kadardır. # Örneğin.03. 0. besiyeri erlende otoklavlanmalı. Bu gibi analizlerde pH metre kalibrasyonunun son derece önemli olduğu açıktır.6'dan 3. Bunun için ölçüm ve ayar yapılacak sınırları açıkça gösteren pH kağıdı kullanılmalıdır. otoklav çıkışında pH ayarlanmalı ve sonra steril tüplere dağıtım yapılmalıdır. besiyeri pH'sından kasıt. katı besiyerine göre çok daha kolaydır. karıştırılır ve Petri kutularına dökülür. # Besiyeri pH'sının sterilizasyon öncesi ayarlanması yanlış olur. Potato Dextrose Agar otoklavlanıp.5'e düşürülmüş olur. Usulüne uygun olarak depolanmış ve raf ömrü bitmemiş ticari dehidre besiyerlerinde nötral su ve temiz cam malzeme kullanılması. Ancak.01 N HCl kullanılarak pH'nın istenilen değere gelmesi için gereken miktar belirlenir. pH ayarlamasında filtre kullanılarak sterilize edilmiş olan 1 N NaOH ve 1 N HCl kullanılır. Pek çok ulusal ve uluslararası standart bu nedenle besiyeri hazırlanmasında "1 litre su ilave edilir.01 N NaOH ya da 0." yerine "1 litreye su ile tamamlanır.Burada ilave edilecek toplam su hacmi 1 litreden daha az olacaktır. # 03. # Tüpte hazırlanacak sıvı besiyerinde pH ayarlaması gerekli ise. Sıvı besiyerinde pH ayarlaması. ilgili talimata göre asit ilavesinden sonra pH kontrolü isteniyor ise buna tümüyle uyulmalıdır. Bu amaçla besiyerinden 10 mL gibi küçük bir örnek alınır. özellikle %50 Glikoz Broth gibi besiyerlerinin hazırlanmasında çok önemlidir. # Sterilizasyon sonrasında pH ayarlanması gerekli ise.
Bu ilavede aşağıdaki konulara dikkat edilmesi gerekir: #-Katkı maddesi asla soğuk olmamalı. antibiyotikler gibi bir kısmı ise küçük şişelerde (vial) liyofilize formdadır. Asitler ve vitaminler ile bazı şekerlerin filtre ile sterilize edilmesi gerekir. # Agarlı besiyerlerinde ise katkı maddeleri agarın henüz sıvı formda kalabildiği yeterince düşük bir sıcaklıkta ilave edilir. Bu işlemde. #-En azından ayda bir kez sıvı besiyerlerinde otoklav sonrası kalibrasyonu yapılmış pH metre ile besiyerinde pH kontrolü yapılmalıdır." şeklindeki görüş geçerli olmakla beraber. -sağlıklı hayvandan aseptik koşullar altında alındığı için. #-Katkı ilave edilmiş agarlı besiyeri hızla Petri kutularına dökülmelidir. agarlı besiyeri ise 45–50 oC'da tutulmalıdır. Petri kutularına döküm ve jelleşme sonrasında hava kabarcıkları görülmüyor ise karıştırma işleminin. Asit ilave edilmiş ise agarın jelleşme gücü zayıflar. Anafor oluşturacak kadar hızlı karıştırma.04. #-Katkı ilave edilecek agarlı (bazal) besiyeri içine sterilizasyon öncesi manyet atılarak beraberce sterilize edilmesi. yumurta sarısı içerenler gibi bir kısmı sıvı halde. Bunlar kırılmış gibi görülüyorsa sulandırılmaları sırasında toz oluşturmayacak 28 . oda sıcaklığında hatta 30–35 oC'da. Aksi halde katkı yüksek sıcaklıktan olumsuz etkilenir ve sahte negatif sonuçlar alınabilir. Bu nedenle manyet. "Doğru depolanmış taze besiyeri ile taze hazırlanmış damıtık su kullanılıyor. # Başta antibiyotikler olmak üzere katkı maddelerinin büyük bir kısmı steril olarak pazarlanır. vitaminler.blender gövdesine ya da stomacher torbasına zarar verir. Bunların üzerine gereken miktarda steril damıtık su (bazen su ve alkol) ilavesinden sonra sterilize edilmiş besiyerine eklenirler. Bu gibi maddeler otoklav sonrasında bazal besiyerine ilave edilir. Bunun en tipik örneği asit–agar etkileşimidir. Ancak bu manyet -eğer kullanılacak ise. #-Gıda işletmelerinin iç standardında her otoklav sonrasında pH kontrolü varsa buna mutlaka uyulmalıdır.steril olduğu kabul edilir. #-Sıvı besiyerine de sterilizasyon öncesi manyet atılması yararlı olur. Katkıların İlavesi # Çeşitli antibiyotikler.Her ne kadar. anafor oluşturacak kadar hızlı yapılan karıştırma ani soğumalara ve/veya besiyeri içinde hava kabarcığı oluşumuna neden olur. Yumurta sarısı içeren çözeltiler pastörize edilmiştir ve bunların steril olduğu kabul edilir. # 03. karıştırma işlemi bittikten sonra erlenden çıkartılmalıdır. tartım doğru yapılıyor ve kurallarına uygun olarak sterilizasyon yapılıyor ise besiyeri pH'sının her defasında kontrolüne gerek yoktur. Kan. Böylelikle bazal (agarlı) besiyerlerinde katkının ilavesi ile ani soğumalar ve yerel jelleşmeler önlenmiş olur. # Küçük şişeler içinde bulunan ve genellikle antibiyotik içeren selektif katkılar şişe içinde tablet gibi durur. # Katkılardan.06. katkı ilavesinden sonra manyetik karıştırıcıda hafifçe karıştırarak katkının besiyeri içinde yeknesak olarak dağılması sağlanabilir. kan ve yumurta sarısı başta olmak üzere besiyeri bileşimine giren bazı maddeler otoklavlama sırasında tahrip olur ya da yüksek sıcaklıkta bileşimdeki maddeler birbirleri ile reaksiyona girer. # Sıvı besiyeri için katkıların ilavesinde herhangi bir sorun yoktur. Besiyeri ve katkı maddeleri oda sıcaklığında aseptik olarak karıştırılır. dolayısıyla katkı ilavesinin agarlı besiyeri çok sıcak iken yapıldığı anlaşılır.
genel olarak belirli bir miktar besiyerinde 1 kerede kullanılmak üzere hazırlanmıştır.07. VRB Agar besiyerinde dökme yöntemi ile kültürel sayımda 10 mL besiyeri dökülmesi. Bu durumda katkıdan steril koşullara uyularak gereken miktarın alınmasından sonra yine steril koşullara uyularak ağzının kapanmasına özen gösterilmelidir.06.şekilde dikkatlice su ilave edilmelidir. Ancak. otoklavlanır. Bu kitapta önerilen standart dökme miktarı 12. Bazı işletmelerde "el altında" bulundurma amacı ile eritilmiş agar tüplere dağıtılır.05. otoklav sonrası besiyerinin yaklaşık 45 oC'a soğutulması ve bu sıcaklıkta Petri kutularına dökülmesidir. Bu miktar. sterilize edilir ve bu şekilde korunur. soğutulduktan sonra üzerine katkı ilave edilir. # Eğer Petri kutusunda "dökme yöntemi ile kültürel sayım" amacıyla önceden ilave edilmiş örnek varsa dökme sıcaklığı 40 oC'ı geçmemelidir. Agarlı besiyeri için doğru uygulama şekli. Örneğin. 29 . Bu konuda 03. # Küçük şişelerde pazarlanan katkılar genellikle 500 ya da 1000 mL besiyeri için hazırlanmıştır. # 03. 1 şişe katkının tümünün 1 defada kullanılması beklenmez. Bu diğer kullanım şekillerinde agarlı besiyeri genellikle anılan kaplarda sterilize edilir. her zaman erlen gibi büyük kaplarda sterilize edilir ve sterilizasyon sonrası steril Petri kutularına aseptik koşularda dökülür. 50 mL yumurta sarısı tellurit emülsiyonu 1 L Baird–Parker Agar hazırlanması içindir ve bu miktardan standart çaplı 80 Petri kutusu hazırlanır. Gerektiğinde eritilip Petri kutusuna aktarılır. # Petri kutularına dökülecek agarlı besiyeri miktarı farklı kaynaklarda farklı değerler ile verilmektedir. Buna göre bazal besiyeri hazırlanır. Çözündürme sırasında kauçuk kapağa sıvının bulaşmamasına özen gösterilmeli ve şişe içeriğinin tam olarak çözülmüş olduğu kontrol edilmelidir. # Katkılar. Bölümde bilgi verilmiştir. jelleştikten sonra üzerine 4–5 mL besiyeri ilavesi pek çok uluslararası standart tarafından önerilmektedir. Agarlı besiyerleri. Ayrıca yüzey kurutması daha uzun zaman alır. Agarlı besiyerlerinin diğer kullanılış şekilleri arasında tüplerde yatık veya dik agar ile Roux şişelerinde kullanım sayılabilir. agarlı besiyerlerinin Petri kutularında sterilize edilmesi uygulanan bir yöntem değildir. Bu uygulamada dikkat edilmesi gereken bir diğer özellik. Bu katkılar. # Benzer şekilde sadece antibiyotik içeren katkıların da depolanması mümkündür. standart 9 cm çaplı Petri kutusunda 2 mm kalınlık).5 mL'dir (100 mL agarlı besiyerinin 8 Petri kutusuna dağıtılması. homojenliğinden emin olmak için çalkalanmalıdır. Petri kutusunun kapağı içinde aşırı su yoğunlaşmasına yol açar. Dairesel yavaş hareketlerle çalkalama erimeyi kolaylaştırır. kendi halinde bırakıldığında genellikle birkaç dakika içinde çözülür. # Agarlı besiyerinin otoklavlama sonrası Petri kutusuna hangi sıcaklıkta döküleceği konusunda pek çok yanlış uygulamaya rastlanmaktadır. Yüksek sıcaklıklarda dökme.03. Petri kutusunda bulunan mikroorganizmaları olası termal şok zararlarından korumak için Petri kutularının oda sıcaklığında tutulması gerekliliğidir. öncelikle Petri kutusu çapı ile ilgili olduğu için agarlı besiyeri döküldükten sonra kalınlığın "en az 2–3 mm" olması yaygın bir şekilde önerilmektedir. Besiyeri dökülmeden önce. Pratik uygulamada. Petri Kutularına Döküm # Otoklav veya daha geniş tarifi ile ısıl işlem ile sterilizasyon sonrası agarlı besiyerleri çoğunlukla Petri kutularına dökülerek kullanılır.
kuruma hızlı olur. sterilizasyon amacıyla kullanılan ve kurutma sırasında çalıştırılmayan etüvler (kuru hava sterilizasyon fırını) ve UV lamba ile sterilize edilen kabinler kurutma için kontaminasyon olmaması açısından en güvenilir yerler arasındadır. Petri Kutularının Kurutulması a) Çabuk kurutma b) Güvenli kurutma # Petri kutularında agarlı besiyeri yüzeyinin çabuk kurutma yönteminde (a).06. Kuru hava sterilizatörlerinde kurutma sırasında sıcaklığın 50 oC'da tutulması hızlı bir kuruma sağlar. Steril hava akımı ile çalışan aşılama kabini (Laminar air flow). Öze ile sürme gibi bir çalışma yapılacaksa. # Kurutma. # Şekil 05. 48 oC'da 4 saat beklemek izin verilebilecek en yüksek sıcaklık/süre kombinasyonudur. # Besiyeri döküldükten sonra Petri kutuları yatay bir zeminde soğumaya ve katılaşmaya bırakılır. # Tersine olarak. Çabuk kurutma sadece acil durumlarda uygulanmalıdır. Prensip olarak benimsenen şekil güvenli kurutmadır. kurutma özellikle yapılmalıdır. # Kurallara uygun olarak Petri kutularına dökümde yüzey hafif nemli olur. Besiyerinin kurutma gerektirip gerektirmediği basit olarak yüzeyde su damlacıklarının görülmesi ile anlaşılır. istem dışı olarak agarlı 30 . Ancak bu uygulamada besiyerinin aşırı kuruma riski de vardır. # Agarlı besiyerleri dökümden sonra bir süre depolanacaksa Petri kutularının tabanına döküm tarihi yazılmalıdır. Yeniden Eritme # Sterilize edildikten sonra soğutulmuş ve jelleşmiş agarlı besiyerlerinin çeşitli nedenlerle yeniden eritilmesi gerekebilir.06. mutlaka temiz ve serbest hava akımı olmayan yerlerde yapılmalıdır. Koloniler aşırı kurumuş bir besiyerinde normalinden daha küçük boyut oluşturacakları için yine hatalı değerlendirmelere neden olur. Diğer uygulama (b). Burada ilk akla gelen iki neden. Kurutma # Petri kutularına dökülmüş agarlı besiyerlerinde yüzeyin ıslak olması istenmez. aşırı kurumalar da olumsuz sonuç verir. tersine olarak geç kuruma ancak düşük kontaminasyon riski sağlar. hareketsizler olduklarından daha büyük koloni meydana getirir ve yanlış değerlendirmelere neden olur. # Dökümden sonra besiyeri yüzeyinin kurutulması gerektiğinde Şekil 05'te gösterildiği gibi 2 farklı yöntem uygulanabilir. # 03.07. ancak kontaminasyon riski yüksektir. Islak yüzeylerde hareketli bakteriler yayılıcı tip koloni oluştururken. Yayma yöntemi ile çalışılacak ise dökme sırasında besiyerinde oluşabilecek hava kabarcıkları bunzen beki alevi ile uzaklaştırılabilir.06. # 03.Herhangi bir nedenle otoklavlandıktan sonra 50 oC su banyosunda uzun süreli beklemeler agarın jelleşme özelliğinde kayıplara neden olur.
Bu azalma. Depolama # Her dehidre besiyeri ve katkı kutusu üzerinde depolama koşulları belirtilir. # Agarlı besiyerlerinin otoklav sonrası tekrar eritilmesinde performans azalması olur. Benzer şekilde yüksek sıcaklığa duyarlı olan besiyerlerinde yeniden eritme önerilmez. # Genel olarak Plate Count Agar gibi basit bileşimli besiyerleri daha az zarar görür. Bu uygulama ise toplam ısı girişi açısından önerilmez. # Hangi nedenle olursa olsun. # Prensip olarak. # Katkı ilave edilmiş agarlı besiyerinin yeniden eritilmesi söz konusu değildir. örneğin. Bazı ticari besiyerleri vida kapaklı şişe içinde pazarlanır. Yeniden yapılacak eritmeler ile performans azalması kabul edilemeyecek düzeye çıkar. Laboratuvardaki iş akışı buna göre planlanmalıdır. besiyerinin bileşimi ile doğrudan ilgilidir. Bununla birlikte. pek çok laboratuvarda çeşitli besiyerleri arasında agarlı besiyerleri de sterilize edildikten sonra steril şekilde belirli bir süre depolanır. Eritme amacıyla aşırı ısıtmadan kaçınılmalıdır. Büyük hacimlerde besiyerlerinin eritilebilmesi için doğal olarak daha yüksek sıcaklık ve/veya süreye gerek vardır.0 verilmektedir. Otoklav bu amaçla kullanılacak ise asla sterilizasyon normunda değil. # Yeniden eritilmiş agarlı besiyerinin 3 saat içinde Petri kutularına dökülmüş olması gerekir. Bunların eritilmesi zaten zorunludur. Otoklavlanmadan ve sadece ısıtılarak sterilize edilen besiyerleri (örneğin Rambach Agar) yeniden eritilmez. katkı ilave edilmiş ve/veya otoklavda sterilize edilmeyen agarlı besiyerleri yeniden eritilmez. Düşük pH'lı besiyerlerini tekrar eritmekten kaçınılmalıdır. Bu uygulama daha çok günlük kontrol yapan laboratuvarlarda.besiyerinin jelleşmesi ile besiyerinin her an kullanılabilecek şekilde elde hazır tutulmasıdır. Bu nedenle agarlı besiyerinin sadece bir kez eritilmesine izin verilir. 1 hafta boyunca kullanılacak besiyerlerini bir kerede hazırlamak amacıyla yapılır. 105 oC'da 5 dakika süre ile ısıl işlem uygulanmalıdır. Burada. Hatta bazı agarlı besiyerlerinin prospektüslerinde yeniden eritilmemesi gerektiğine özellikle dikkat çekilir. katkılar buzdolabı sıcaklığında 31 . Bazılarında "eritme" seçeneği vardır. # # 03. Bazı otoklavların 90 oC'a ayarlanması mümkün değildir. eritilecek besiyeri hacminin önemli olduğu açıktır. # Agarlı besiyerinin eritilmesi gerektiğinde elden geldiği ölçüde az ısı girişinin sağlanması. jelleşmiş bir agarlı besiyerinin yeniden eritilmesi için 90 oC'da 1– 2 dakika tutulma zorunluluğu vardır. Agarlı besiyerlerinin yeniden eritilmesinde mikrodalga fırınlar da başarıyla kullanılmaktadır. burada sınır olarak pH 6.07. bu amaçla kaynar su banyosunda yaklaşık 90 oC'da tutularak erimenin gerçekleştirilmesi yeterlidir. # Eritme amacıyla otoklav da kullanılabilir. Basit bir şekilde dairesel hareketlerle yapılan çalkalamada hava kabarcıkları merkeze toplanıyorsa besiyerinin tümüyle erimiş olduğu anlaşılır. Genel olarak dehidre besiyerleri oda sıcaklığında nem almayacak şekilde.
anorganik bileşenler organiklere kıyasla çok daha uzun süre ile depolanabilir. ilk açıldığında renk.5 nem almış olanda ise %22 olarak bulunmuştur. Genel olarak. Nem almış ya da açıkça fiziksel değişim gösteren dehidre besiyerleri hiçbir koşulda mikrobiyolojik analizlerde kullanılamaz. serin bir yerde depolanan ve kapağı açılmamış ambalaj ya da açıldıktan sonra doğru (serin ve kuru yerde. Bu işlemin çeker ocak sisteminde yapılması gerekir. Bunun nedeni buzdolabından çıkarıldıktan sonra kutu üzerindeki kondensasyon riskidir. Orijinal ambalaj kapağının açılmasından sonraki raf ömrü. # Kapağı açılmamış bir dehidre besiyerinin raf ömrü genellikle 3–5 yıl kadardır. renk değişimi vb. Salmonella–Shigella Agar besiyerinde şahit Salmonella kullanılarak yapılan bir çalışmada. # Aksine ve net bir uyarı yoksa dehidre besiyerlerinin oda sıcaklığında (15–25 oC) depolanması yeterlidir. kullanımdan sonra dehidre besiyeri kapaklarının sıkıca kapatılması ve bunların kuru bir yerde depolanmasıdır. # # # # 32 . # Dehidre besiyerlerinin buzdolabında saklanması önerilmez. # Kutu ilk açıldığı gün envanter kayıt defterine ve kutu üzerine açılış tarihi kaydedilmeli. # Bu bilgiler ışığında.1 nem almış besiyerinde %47.01. Dehidre Besiyerlerinin Depolanması # Kapağı açılmış besiyerleri ve besiyeri bileşenleri kuru. kutu üzerindeki uyarılara dikkat etmek ve bunlara tümüyle uymak gereklidir. Bazı besiyerleri ambalajlarında 15 oC altında saklanması önerisine uyulması gerekir.07. # Dehidre besiyerinin kalitesindeki kayıp. dehidre besiyerlerinin otoklav. # Burada verilen tüm bilgiler dehidre haldeki besiyeri bileşenleri için de geçerlidir. %5. Ancak bu tarihin. kalıplaşma. Kutu açıldıktan sonra dehidre besiyerinin vida kapaklı renkli şişelere dağıtılarak ve ağızları sıkıca kapandıktan sonra kuru ve serin bir yerde tutulmaları raf ömrünü kayda değer ölçüde uzatır. Hazırlanmış besiyerlerinin depolanma kuralları daha farklıdır. kutu ağzı sıkıca kapatılmış olarak) depolama yapılması koşulunda geçerli olduğu unutulmamalıdır. saklama koşullarına doğrudan bağlıdır. Ticari firmalar tarafından üretilen besiyeri ambalajlarında son kullanım tarihi yazmaktadır. Bu şekilde kullanım sırasında tüm besiyeri yerine sadece daha küçük bir ambalaj açılmış olur. yıkama odası. su banyosu ve kaynar su banyosu yakını gibi nemin yüksek olduğu yerlerde ve doğrudan güneş ışığı alan dolaplarda depolanmaması gereği ortaya çıkar. # Nemden korumanın en emin yolu. topaklanma ve kalıplaşma belirtileri için görsel olarak kontrol edilmelidir.depolanır. homojen yapı göstermeme. ile anlaşılır. Bununla beraber. Toz haldeki besiyeri ve bileşenleri için en büyük tehlike bunların nem almasıdır. Daha küçük kaplara dağıtımda dehidre besiyeri aşırı toz bulutu oluşturabilir ve bunun solunması zararlıdır. kontrol örneğine kıyasla geri alma oranları %1. # 03. karanlık ve serin bir yerde saklanmalıdır. toz akışında değişim.
# Sadece antibiyotik içeren katkılar sulandırıldıktan sonra uygun küçük miktarlar halinde (örneğin steril Eppendorf tüplerinde) dondurularak saklanabilir. Hazırlanmış Besiyerlerinin Depolanması # Çoğu laboratuvarda. bunların ağzı iyi kapatılan kaplarda depolanması gerekir. Bununla birlikte. # 03. plastik Petri kutusu.07. Çoğu katkı için ağzı açılmamış (ya da açıldıktan sonra sıkıca kapatılmış halde. üzerlerine steril damıtık su ve/veya alkol eklenerek kullanıma hazır hale getirilir. Buna göre tercihen cam çözelti şişelerinde ve oda sıcaklığında depolanabilirler. depolama koşullarına bağlıdır. Çözeltilerin Depolanması # Laboratuvarda hazırlanmış çözeltilerin pek çoğu ışığa duyarsızdır ve soğukta saklanması gerekmez. Bunların depolanabilme süresi öncelikle bileşimine ve saklama koşullarına bağlıdır. diğerlerine göre daha stabildir ve buna bağlı olarak daha kolay depolanabilirler. Benzer şekilde bazı çözeltiler buz dolabında korunmalıdır. kendi hazırlama.03. soğuk ve kuru bir yerde) olmak kaydı ile depolama süresi 3–5 yıldır. bazıları bir süre depolanabilir.02.) olduğuna. cam Petri kutusu vb. Her laboratuvar. konsantrasyon değişikliğine neden olacağı için. # Hazırlanmış besiyerlerinin stabilitesi sınırlıdır. # Hazırlanmış besiyerlerinin ne kadar süre ile depolanacağı öncelikle besiyeri bileşimine. # Işığa duyarlı olan çözeltilerin amber renkli şişelerde depolanması gerekir. ağzı açık kaplarda uzun süre beklerse konsantrasyonu düşer ve buna bağlı olarak dezenfeksiyon etkisi azalır. basit bileşime sahip ve içinde katkı içermeyen besiyerleri.07. 33 . Çözeltilerde nem kaybı olması. # ISO 11133'e göre besiyerleri katkı ilave edilmemiş olmak kaydı ile buzdolabında en çok 3 ay. vida kapaklı şişe. # 03. # Bazı katkılar. # Katkıda dondurma kaynaklı potansiyel aktivite kaybı olup olmadığı kullanıcı tarafından kontrol edilmeli ve bu şekilde bir katkının bazal besiyerine ilave edildiği laboratuvar kayıtlarında belirtilmelidir. Bunlardan bazılarının hazırlandıkları gün kullanılma zorunluluğu varken. bu şekilde talimatlara geçmelidir. besiyerleri hazırlandıktan sonra sterilize edilir ve daha sonra kullanmak üzere depolanır. Bu uygulamaya çeşitli besiyeri katkıları da girer.07. Genel olarak. Katkıların Depolanması # Aksine bir uyarı yoksa besiyeri katkıları 2–8 oC'da depolanır.03. hangi ambalajda (tüp. Yumurta sarısı içeren katkılarda bu süre daha azdır.04. şekillerde kullanıma hazır halde besiyerleri sağlanabilmektedir. Alkol uçucu olduğu için. bazı besiyerlerinin hazırlandığı gün kullanılma zorunluluğu vardır. Laboratuvar personeli bu konuda çok dikkatli olmalıdır. oda sıcaklığında en çok 1 ay süre ile depolanabilir. vida kapaklı şişelerde vb. Benzer şekilde kullanıma hazır halde Petri kutularında. Bu şekilde depolanmış olan çözeltiler eritildikten sonra tekrar dondurulmamalıdır. paketleme ve saklama koşullarına göre hazırlanmış her besiyeri için depolama süresini belirlemeli.
# Sıcaklık Hazırlanmış besiyerleri elden geldiği ölçüde serin ortamlarda tutulmalıdır. Bu tip cam malzemede kap ağzının parafilm veya mutfak tipi strech film ile sarılması nem kaybını önemli ölçüde önler. Gram negatif bakteriler besiyerindeki kurumaya bağlı olumsuzluklardan daha fazla etkilenir. # Basit bir örnek olarak. Petri kutusundaki besiyerinde nem kaybı tüptekinden çok daha fazla olacaktır. erlen ve balonlarda hazırlanmış besiyerlerinde nem kaybının önlenmesi kolaydır. # Depolanacak Petri kutularında yüzey kurutması yapılmamalıdır. Standart laboratuvar tüpünde hazırlanmış Nutrient Agar besiyeri ile sterilizasyondan sonra Petri kutularına dökülmüş Nutrient Agar arasında yüzey/hacim oranı farklılığından kaynaklanan bir nem kaybı farklılığı vardır. Ayrıca kuruma yüzey ve yüzeye yakın yerlerde çok daha fazla olur. özellikle selektif besiyerlerinde selektivite veren bileşenlerin %20 konsantrasyon artışı pek çok sahte negatif sonuca yol açar. # Petri kutularında nem kaybını önlemek daha güçtür. özellikle agarlı besiyerlerinin dondurulmasından kesinlikle kaçınılması gerekir. Kuşkusuz. Rose Bengal gibi bazı bileşenler ışığa aşırı duyarlıdır. 06.01. # Nem # Dehidre besiyerinin nem alması ne denli istenmiyor ise hazırlanmış besiyerlerinde nem kaybından da o denli kaçınmak gerekir. kurutma bu aşamada yapılmalıdır. Bu konuda da yine ev mutfaklarında çeşitli gıdaların vakum altında tutulması için üretilmiş basit makinelerden ve bunların özel torbalarından yararlanılabilir. ancak raf ömrünü kayda değer ölçüde uzatan bir uygulamadır. Petri kutularını vakum altında depolamak önerilebilir. kapakların tam olarak kapanmasına bağlı olarak cam olanlara göre daha az nem kaybı olur. # Genel olarak plastik Petri kutularında. depolama başlangıcında 5 mm olan agarlı besiyeri kalınlığı depolama sürecinde 4 mm'ye inerse. Agarlı besiyerinde depolama sırasında (dara hariç olmak üzere) %15 ağırlık kaybı izin verilen sınırdır (bakınız.08. Bu olanak yoksa Petri kutularının mutfak tipi strech film ile sarılarak depolanması basit. Tüplerde. peroksitler gibi bakterisit ve bakteriostatik bileşiklerin oluşmasını önlemek için renkli şişelerde ya da doğrudan ışık almayacak şekilde depolanmalıdır. 47.Hazırlanmış besiyerlerinde raf ömrünü belirleyen en önemli faktörler aşağıda kısaca açıklanmıştır. Standart depolamada ilave bir önleme gerek yoktur. Dolayısı ile bu bileşeni içeren hazırlanmış bir besiyerinin bulunduğu Petri kutularının (bakınız. # Işık # Hazırlanmış besiyerleri. # Petri kutularına dökülerek depolanacak agarlı besiyerlerinde nem kaybının önüne geçilmesi için. Besiyerinde ozmotik değişmeler olması yanında. bu durum çok yaklaşık olarak %20 nem kaybının göstergesidir.02. Ancak. 34 . Eğer kullanım öncesinde yüzeyde bir ıslaklık görülürse. Bölüm). ve 47. Bölüm) mutfak tipi alüminyum folyo ile sarılarak depolanması (hatta inkübasyonu) önerilir.
4 hacim alkol üzerine 1 hacim damıtık su eklendiğinde çok yaklaşık olarak bu değer elde edilir. Hazırlanmış besiyerlerinin standart buzdolaplarının çok soğuk olmayan orta ve alt bölmelerinde depolanması yaygın ve doğru bir uygulamadır. # İzin verilen sapma hacmi ±%2'dir. asitler ve bazlar ile boyalar vardır. # # 03. Alkol. sol alt köşeye 0 (sudaki alkol konsantrasyonu) karenin merkezine 76 (hedeflenen konsantrasyon) yazılır. agarın jelleşme özelliğine önemli ölçüde zarar verir. Genellikle %96 konsantrasyonda pazarlanır. Bunlar genel olarak. Buna göre. Kan. Pearson karesi ile hesaplama yapılır. yumurta sarısı–tellurit emülsiyonu ve antibiyotik ilave edilmiş besiyerleri ise 2–8 oC'da depolanmalıdır. nedeni araştırılıp. Aksine bir uyarı yoksa genel olarak hazırlanmış besiyerleri 4–12 oC'da karanlık ve nem kaybetmeyecek şekilde depolanmalıdır. Bu amaçla her 25 şişeden biri "A sınıf" dereceli silindir ya da eşdeğeri ile kontrol edilir.08. # Derişik çözeltilerden daha seyreltik olanların hazırlanmasında. "Normal" çözeltilerin hazırlanmasında önce molekül ağırlığı hesaplanır. Laboratuvarda hazırlanarak kullanılan diğer çözeltiler arasında alkol. Köşegenler boyunca fark alınarak elde edilen değer diğer köşelere yazılır. Rambach Agar gibi bazı besiyerleri için en düşük depolama sıcaklığı 6 oC'dır. Pearson karesi. Molekül ağırlığı. yumurta sarısı. # Bileşimi bağlı olmak üzere hazırlanmış besiyerleri için değişik depolama sıcaklıkları önerilmektedir. 76 – 0= 76 sağ üst köşeye yazılarak kare tamamlanır. Hacim değişliklerinin temel nedenleri arasında otoklavın yanlış kullanılması da vardır. Buna göre 96 – 76= 20 sağ alt köşeye. istenirse 11 mL ilavesi ile 1:10 seyreltme için kullanılabilir. 35 .Dondurma. 99 mL olarak hazırlanan çözeltiler istenirse 1 mL ilavesi ile 1:100. dezenfektan olarak %76 (v/v) konsantrasyonda kullanılır. Çözeltilerin Hazırlanması # Mikrobiyoloji laboratuvarında en çok kullanılan çözeltiler seyreltme amaçlı olanlardır. düzeltici uygulama yapılmalı ve kayda geçilmelidir. Daha fazla sapma olursa. Fraser Broth gibi bazı besiyerlerinde katkı ilave edildiği gün kullanılması gerektiği unutulmamalıdır. Aşağıda basit bir örnekle derişik olandan daha seyreltiğin hazırlanması verilmiştir: # #-%96'lık alkolden damıtık su ile %76'lık alkol hazırlanması için sol üst köşeye 96. % (dolayısı ile ppm gibi) ifade edilen çözeltiler için kullanılır. 90 ve 9 mL hacimde hazırlanır. Sonra karenin alt ve üst kenarları boyunca okuma yapılır: %96 konsantrasyondaki alkolden 76 kısım ve %0 konsantrasyonlu alkolden (damıtık su) 20 kısım karıştırıldığında %76'lık alkol elde edilir. Çiğ süt örneklerinde doğrudan 100 misli seyreltme için bu çözeltiler 99 mL olarak da hazırlanabilir. # ⇒ %96'lık alkolden 76 hacim # ⇒ %0'lık alkolden 20 hacim # Mikrobiyoloji laboratuvarlarında pH ayarlamak amacıyla genellikle 1 N NaOH ve 1 N HCl kullanılır. # 90 (ya da 99) mL olarak hazırlanan dilüsyon şişesindeki (erlendeki) sıvı hacmi sterilizasyondan sonra oda sıcaklığında kontrol edilir. bileşikteki atom ağırlıkları toplamıdır.
# Asitlerden yapılan hesaplamalarda derişim de dikkate alınır. NaOH için tesir (etki) değeri: 1 olduğuna göre 40 g/L çözelti aynı zamanda 1 Normaldir. en az 0.aşağıdaki kontrollerin kullanıcılar tarafından yapılması yararlı olacaktır: #-Önce. ekimlerin her iki grup besiyerinde beraberce (paralel) yapılması ile bir anlamda yeni kutu için kalite kontrol yapılmış olur. # Çözeltiler konusunda ayrıntılı bilgi www. orijinal ambalajın fiziksel olarak zarar görmemiş olduğu kontrol edilir. halen kullanılmakta olan kutudan son parti besiyeri hazırlanırken yeni kutunun açılması. Burada dikkat edilecek konu HCl'in.NaOH için molekül (mol) ağırlığı. #-Aynı uygulama besiyeri katkıları için de yapılmalıdır. # Buna göre. bileşimi ve gerekli görülen diğer bilgiler şişe üzerinde açıkça belirtilmeli. topaklaşma gibi kontroller yapılır. 1 N (1 M) HCl hazırlamak için son konsantrasyon 36. # Dehidre besiyerleri. # 1 litre damıtık su içinde 40 g NaOH çözülmesi ile elde edilen çözelti 1 Molar (M) olarak tanımlanır.org sitesinden sağlanabilir. Örneğin. #-Laboratuvarda sık kullanılan dehidre besiyerleri için. Bu şekilde hazırlanmış çözeltide 36. # Sterilize edilmiş çözeltilerin kontamine edilmemesine özen gösterilmeli. Her iki grupta. Na: 23.5 g/L olacak şekilde damıtık su üzerine asit ilave edilir (hiçbir koşulda asit üzerine su ilave edilmez). # Çözeltinin hazırlandığı tarih.kimyaevi. #-Besiyeri üreten firmalar tarafından hazırlanan kataloglarda hangi besiyerinde hangi mikroorganizmaların nasıl gelişeceği "kalite kontrol mikroorganizmaları" adı altında 36 . 54 g/L çözelti 1 N'dir. Kapak açıldıktan sonra renkte anormallik. Besiyeri Kalite Kontrolü # Besiyeri üreten firmalar. etiket üzerindeki yazıların silinmemesi sağlanmalıdır. H: 1 olmak üzere 40'tır.5 g/L saf HCl bulunur. NaOH gibi katı ve saf olmadığıdır. # Yukarıda besiyerlerinin formülden hazırlanması bölümünde örneği verilmiş olan MgSO4'ın mol ağırlığı 108 gram ve tesir değerliği 2'dir. O: 16. # # 03. bu kutudan da yeteri miktarda besiyeri hazırlanması. bileşenleri ve katkılarını kullananlar için ilave kontrol uygulamalarına genellikle gerek duyulmaz. istatistik olarak analiz yapılmak üzere birbirlerinden farksız sonuç alınması gerekir. Molekül ağırlığının tesir değerine bölünmesi ve çıkan değerin 1 litre suda çözülmesi ile 1 Normal (N) çözelti elde edilir. ISO 11133 sayılı standart üretici firmanın yükümlülüklerini belirlemektedir. -özellikle kuşku duyulmayı gerektirecek bir durumla karşılaşıldığında. ürettikleri ve pazarladıkları dehidre besiyerleri.09. kuşku duyulursa bu çözelti asla kullanılmamalıdır.1 mL alınıp. Buna göre 108 g/L çözelti 1 M. hazır besiyerleri ve katkılarını sistematik olarak kalite kontrolden geçirmektedirler. standart derişik (%38) HCl asitten 80.5 litre damıtık suya ilave edilir ve sonra damıtık su ile litreye tamamlanır. Buna karşın.
öncelikle besiyerini pazarlayan firmayla temas kurulmalıdır.10. besiyerinin çok eski olması. #-Dehidre besiyerinde topaklaşma: Depolamada aşırı nem. düşük pH. #-Besiyerinde kararma: Aşırı ısıtma. dehidre besiyerinin çok eski olması. hazırlamasında damıtık su kullanılmamış besiyerlerinde pek çok hata görülmektedir. #-Zayıf jelleşme stabilitesi: Hatalı tartım. #-Aşırı gelişme: Selektif inhibitörlerin bozulacağı kadar aşırı ısıtma veya selektif katkıların yüksek sıcaklıkta bazal besiyerine ilavesi. #-Yanlış pH: Nötral olmayan su kullanımı. # # 03. nem almış. selektif inhibitörlerin bozulacağı kadar yüksek sıcaklıkta katkı ilavesi. cam malzeme ve/veya sudan çeşitli inhibitörler ve/veya yabancı maddelerin kontaminasyonu. #-Zayıf gelişme: Yetersiz yıkanmış ve/veya durulanmamış cam malzemeden inhibitör madde kontaminasyonu. yetersiz yıkanmış cam malzeme kullanılması. #-Atipik gelişme: Besiyerinin hatalı hazırlanması. # 37 . hatalı pH. inhibitör içeren besiyerlerinde standart dışı uzun süre depolama. dehidre besiyerinin çok eski olması. yanlış pH. dehidre besiyerinin çok eski olması. aşırı ısıtma. Laboratuvarda sürekli analizi yapılan mikroorganizmaların basit bir koleksiyonu ve otokontrol içerikli çalışmalar 09. Bu mikroorganizmaları besiyeri üreten ve/veya pazarlayan firmalardan sağlamanın maliyeti çok yüksek olabilir. pH metre kalibrasyon hatası. Bu gibi hatalar gösteren ya da hatalı olduğundan yana kuşku duyulan besiyerleri mikrobiyolojik analizlerde kullanılamaz. yanlış tartılmış. bileşimden hazırlanmış besiyerlerinde temel bileşen(ler)'in yeterli saflıkta olmaması. Besiyeri Hataları # Besiyerlerinde. dehidre besiyerinin nem alması. doğrudan analiz sonucuna yansıyabilecek çeşitli hatalar ile bunların olası nedenleri aşağıda listelenmiştir. erimiş halde uzun süre ile su banyosunda bekletme. dehidre besiyerinin çok eski olması. selektif inhibitörlerin eksik tartımı/ilavesi. sulandırmadan sonra sterilizasyonun zamanında yapılmaması. pH'nın yanlış sıcaklıkta ölçülmesi. Görüleceği gibi. temiz olmayan cam malzemenin kullanılması. hazırlanmış besiyerinde depolama sırasında nem kaybı. #-Yüksek jelleşme sıcaklığı: Hatalı tartım. uygun olmayan agar kullanılması. #-Kolonilerin yayılması: Besiyeri yüzeyinin çok ıslak olması. #-Bulanıklık ve presipitasyon: Saf olmayan suyun kullanılması. dehidre besiyerinin çok eski olması. aşırı ısıtma. #-Anormal renk: Saf olmayan su kullanımı. aşırı ısıtma.gösterilir. yanlış tartım. kirli cam malzeme. aşırı ısıtma. hazırlanmış besiyerinin uygun olmayan koşullarda ve/veya uzun süreli depolanması. hatalı pH. besiyeri ve katkılarının hatalı tartımı ve/veya hatalı ilavesi. Bölümde ayrıntılı olarak anlatılmıştır. dehidre besiyerinin çok eski olması. #-Besiyerinde kullanıcı tarafından çözülemeyen bir hata kaynağı varsa. dehidre besiyeri kutu kapağının nemli bir ortamda uzun süre açık kalması ve/veya gevşek kapatılmış olması. dehidre besiyerinin tam çözülmeden dağıtılmış olması. aşırı ısıtılmış. asidin besiyeri çok sıcakken ilave edilmesi. hatalı tartım. aşırı ısıtma.
asit. soluma. Baird–Parker Agar ve Fraser Broth gibi bazı besiyerlerinin bileşiminde yer alır. bir kısmının etkisi çok uzun süre sonra görülür. Solunum sistemi. göz ile temas ve yutma yolu ile çalışanlar için potansiyel hastalıklar oluşturur. Listeria besiyerlerinin bazılarında bulunur. selenit. Solunum sisteminde mukoza irritasyonu ile öksürüğe. Toksik doz. kusma ve ishale neden olur. Ancak besiyerine ilave edildiğinde konsantrasyon. deri ve gözde tahriş yapar. # Ayrıca. tehlikeli olabilecek düzeyin altına iner. talyum gibi bazı kimyasallar ile çalışılırken özel önlem alınması gerekir. perfringens için hazırlanmış bazı besiyerlerinin bünyesinde bulunur. deri ve gözde tahriş yapar. zehirli maddeler ile toz gibi zararlı maddeler içerir. Koliform grup bakteriler için kullanılan bazı besiyerlerinde bulunur. görme bozukluğu ve kalp ritim bozukluğuna neden olur. Gram pozitiflerin inhibisyonu için başta VRB Agar olmak üzere bazı koliform grup bakteri besiyerleri bileşiminde bulunur. Bu selektif katkı ile çalışılırken dikkatli olunması gerekir. bazı besiyeri bileşenlerinin çevre açısından kirlilik oluşturduğu da dikkate alınmalı. -Lithium choride: Yutulması zararlıdır. deri ve gözde tahriş yapar. -Nalidixic acid: Solunum sistemi. Bileşimden hazırlanan bazı besiyerlerinde kullanılır. deride tahrişe. deri ve gözde tahriş yapar. deri ve gözde tahriş yapar. deri ile temas.03. Tehlikeli Maddeler # Dehidre besiyerleri safra tuzları. Pseudomonas aeruginosa ve Fraser Broth gibi bazı Listeria besiyerlerinin bileşiminde bulunur. Özellikle Pseudomonas aeruginosa ve Salmonella için hazırlanmış RVS Broth gibi bazı besiyerlerinin bileşiminde bulunur. Başta Cetrimide Agar olmak üzere Gram pozitif bakterilerin inhibisyonu için bazı Pseudomonas besiyerlerinde bulunur. buna göre besiyeri ve bileşenlerinin çöpe atılmasında gereken özen gösterilmelidir. Fekal streptokoklar ve Cl. 38 . Koliform grup bakteriler için kullanılan bazı besiyerlerinde bulunur. Genel bakteri inhibitörü olarak DRBC ve RBC gibi bazı maya–küf besiyerleri bileşimindedir. Gram pozitifleri inhibe eder. -Deoxycholate: Solunum sistemi. Bunların bir kısmı vücuda kontamine olduğu anda etkisini gösterir. Salmonella ve koliform grup bakteriler için hazırlanmış bazı besiyerlerinin bünyesinde bulunur. #-Cetrimide: Yutulması zararlıdır. deri ve gözde tahriş yapar. -Kanamycin: Solunum sistemi. -Malachite green: Solunum sistemi. #-Bile salts (safra tuzları): Mukoz membranları tahriş eder. Aşağıda insan sağlığı için tehlikeli olan kimyasallara örnekler verilmiştir: #-Barbitone: "Narkotik" grupta değerlendirilir. Tehlikeli maddeler başlıca. #-Cycloheximide: Selektif katkı olarak bulunduğu konsantrasyonu tehlikelidir. göz ve deride tahriş yapar. #-Brilliant green: Solunum sistemi. deri ve gözde tahriş yapar. göze bulaşması halinde irritasyona yol açar. # Bazı besiyerlerinin bileşiminde insan sağlığı açısından tehlikeli maddeler bulunur. #-Chloramphenicol: Solunum sistemi. deri ve gözde tahriş yapar. boyalar vb. Toz besiyerleri kullanıldığında tartım sırasında yayılan tozu solumamak için önlem alınması önerilir.11. #-Crystal violet: Solunum sistemi. Bu maddelerden bir kısmı sadece bu maddelere duyarlı kişiler için önemli iken.
#-Sodium thioglycollate: Solunması ve yutulması toksik etki yapar. #-Sodium selenite: Solunması ile bronşiyal spazmlara. Bileşimden hazırlanan bazı besiyerlerinde bulunur. deriyi tahriş eder. #-Sodium azide: Dehidre besiyerlerinde az miktarda bulunmakla beraber. Enterokoklar için hazırlanan besiyerlerinin bazılarında bulunur. #-Sodium metabisulphite: Asit ile temasında toksik bir gaz olan sodium dioxide oluşur. # 39 . Staphylococcus için hazırlanan besiyerlerinin çoğunda. E. Campylobacter analizinde kullanılan Bolton Selective Enrichment Broth (Base) bileşiminde bulunur. Sodium azide. coli O157:H7 için kullanılan CT–SMAC Agar besiyeri katkısında bulunur. Çözeltisi deri ve gözde tahriş yapar. Bu nedenle sodium azide içeren besiyerleri yıkama sırasında önce bol su ile muamele edilmelidir. Teratojenik potansiyeli olduğundan doğurgan yaşta kadınlar bu madde ile çalışmaları sırasında çok dikkatli olmalıdır. Selenite Cystine Broth gibi bazı Salmonella besiyerlerinde yer alır. Kümülatif etki riski vardır. %1'den yüksek konsantrasyonlar ile çalışılırken gereken önlem alınmalıdır (örneğin. solgunluk ve mide şikâyetleri oluşur. Sindirilmesiyle bulantı. deri ve gözde tahriş yapar. #-Thallium salts (talyum tuzları): Solunması veya sindirilmesi toksik etki yapar. Bunların dışında. alerjik reaksiyonlara neden olabilir. başta bakır olmak üzere metaller ile temas ettiğinde patlayıcı metal azitleri oluşturur. böbrekler ve merkezi sinir sistemine zarar verir. Kümülatif etki riski vardır. bu gaz solunum sistemi ve deriyi tahriş eder. Anaeroblar için kullanılan bazı besiyerlerinin bileşiminde yer alır. bazı kişilerde aşırı duyarlılık görülebilir. çeker ocak). boğulma ve zatürre semptomlarına yol açar. Karaciğer.#-Potassium tellurite: Solunum sistemi.05 oranında katılarak Listeria monocytogenes zenginleştirmesinde kullanılabilir. sodium azide asitlerle temas ettiğinde toksik gaz oluşturur. Nutrient Broth'a %0.
This action might not be possible to undo. Are you sure you want to continue?
We've moved you to where you read on your other device.
Get the full title to continue reading from where you left off, or restart the preview.