Terapevtik qo'llash uchun a'zolarga xos to'qimalarni yaratish katta muammo bo'lib, ~ 108 hujayra / ml dan tashkil topgan zich hujayrali konstruktsiyalarni ishlab chiqarish va saqlashni talab qiladi.Bemorga xos bo'lgan pluripotent ildiz hujayralaridan olingan organoidlardan tashkil topgan organ qurilish bloklari (OBB) kerakli hujayra zichligi, mikroarxitekturasi va funktsiyasi bilan to'qimalarga erishish yo'lini taklif qiladi.Biroq, bugungi kunga qadar ularni 3D to'qimalar konstruktsiyalariga yig'ishga kam e'tibor berilgan.Bu erda biz o'rnatilgan uch o'lchovli bioprinting orqali qon tomir kanallari kiritiladigan yuqori hujayra zichligi bo'lgan jonli matritsalarga yuz minglab OBBlarni yig'ish uchun bioishlab chiqarish usuli haqida xabar beramiz.OBB matritsalari funktsional to'qimalarga (SWIFT) qurbonlik yozish uchun zarur bo'lgan o'z-o'zini davolash, viskoplastik xatti-harakatni namoyish etadi.Misol tariqasida, biz 7 kun davomida birlashadigan va sinxron ravishda uradigan yurak to'qimasini yaratdik.Bizning SWIFT bioishlab chiqarish usuli terapevtik miqyosda perfuziya qilinadigan bemor va organlarga xos to'qimalarni tez yig'ish imkonini beradi.
Terapevtik maqsadlarda foydalanish uchun butun organlarni qurish qobiliyati juda qiyin vazifa bo'lib qolmoqda, bu esa milliardlab hujayralarni keng tarqalgan tomir kanallari orqali ozuqa moddalari bilan ta'minlangan funktsional mikroarxitektura birliklariga tezda tashkil etilishini talab qiladi (1).Osonlik bilan o'tadigan qon aylanish tarmog'i bo'lmasa, ishlab chiqarilgan inson to'qimalarining qalinligi bir necha yuz mikrometrlar bilan cheklangan (2-10).Ushbu cheklov implantatsiya va xost tomirlari bilan anastomoz o'rtasidagi kechikish tufayli yuzaga keladi, bu hujayra hayotiyligini ta'minlash uchun kislorod va ozuqa moddalarining diffuziv tashishiga tayanishni talab qiladi (2, 8, 9).Garchi avaskulyar to'qimalar transplantatsiyasi implantatsiyadan so'ng organ funktsiyasining o'lchovli yaxshilanishini ta'minlashi mumkin bo'lsa-da (3, 8, 9), uch o'lchovli (3D) greftlarning de novo biomahsuloti va oxir-oqibat, to'liq miqyosli organlar muqarrar ravishda qon tomir tarmog'ini talab qiladi.3D vaskulyarizatsiyalangan to'qimalar (~ 1 sm qalinlikdagi) yaqinda multimaterial 3D bioprinting (11, 12) va stereolitografiya (13) orqali ishlab chiqarilgan bo'lsa-da, ular fiziologik jihatdan mos keladigan funktsiya darajalariga erishish uchun zarur bo'lgan hujayra zichligi va mikrostruktura murakkabligiga ega emas.Hujayradan tashqari matritsalarda (ECM) to'xtatilgan alohida hujayralardan tashkil topgan, ya'ni jellardagi hujayralar deb ataladigan muhandislik to'qimalari, odatda, in vivo jonli ravishda kuzatilganidan kamida bir-ikki daraja pastroq hujayra zichligini o'z ichiga oladi (1, 14).
Inson embrion ildiz hujayralari va induktsiyalangan pluripotent ildiz hujayralari (iPSCs) o'z-o'zini yig'ish bo'yicha so'nggi yutuqlar in vivo organlardagi hamkasblariga o'xshash bir qator xususiyatlarga ega organoidlarning rivojlanishiga olib keldi (15-17).Aksariyat organoid protokollar [masalan, miya (16), buyrak (17-19) va yurak (20) organoidlar] mikroquyruqlarga joylashtirilgan va statik sharoitda o'stirilgan ko'plab iPSClardan tashkil topgan embrion tanalarni (EB) hosil qilish bilan boshlanadi, ularning farqlanishi mumkin. qiziqtirgan "mini organlar" ga yo'naltirilgan.Biz ushbu organoidlar kerakli hujayra zichligi, tarkibi, mikroarxitekturasi va funktsiyasiga ega bo'lgan bemor va organlarga xos to'qimalarni bioishlab chiqarish uchun ideal organ qurilish bloklari (OBB) bo'lib xizmat qilishi mumkin, deb o'ylaymiz, agar qon tomir kanallarining o'tkazuvchan tarmog'i ushbu tirik organizmlarga kiritilishi mumkin bo'lsa. matritsalar.
O'rnatilgan 3D bosib chiqarish ushbu maqsadga erishish uchun bitta samarali strategiyani taklif qiladi.Lyuis va boshqalar.birinchi bo'lib hujayrasiz gidrogel (21) va silikon (22) matritsalari ichida viskoelastik, qurbonlik (yoki qochqin) siyoh yozish orqali ushbu usulni ko'rsatdi.Chop etilgandan so'ng, bu matritsalar davolandi va qurbonlik siyohlari olib tashlandi va o'zaro bog'langan kanallarning 3D tarmog'ini qoldirdi.Ushbu muvaffaqiyatga asoslanib, boshqa tadqiqotchilar sintetik (23) va biopolimer (24, 25) matritsalarni ishlab chiqdilar, ular murakkab 3D arxitekturalarining naqshini soddalashtiradigan o'z-o'zidan davolovchi, viskoplastik javob beradi.Biroq, hozirgi kunga qadar bu usullar faqat hujayrali (23, 24) yoki kam hujayrali (25) matritsalarni qurish uchun ishlatilgan.
Bu erda biz yuqori hujayra zichligi, etukligi va kerakli funksionallikka ega bo'lgan organga xos to'qimalarni yaratish uchun tirik OBB matritsasidan tashkil topgan funktsional to'qimalarga (SWIFT) qurbonlik yozishga asoslangan bioishlab chiqarish usuli haqida xabar beramiz (1-rasm).Birinchidan, biz EBs, organoidlar yoki ko'p hujayrali sferoidlar shaklida yuz minglab iPSC-dan olingan OBBlarni yaratamiz.Keyinchalik, bu OBBlar qolipga joylashtiriladi va tirik OBB matritsasi hosil qilish uchun sentrifugalash orqali siqiladi.Keyin biz o'rnatilgan 3D bosib chiqarish orqali ushbu matritsa ichida qurbonlik siyohini tezda naqsh qilamiz, bu olib tashlangandan so'ng bitta yoki shoxlangan o'tkazgichlar ko'rinishidagi o'tkazuvchan kanallarni beradi.Nihoyat, biz ko'rsatamizki, bu katta qon tomir to'qimalar uzoq vaqt davomida perfuziyalanganda ishlaydi va etuk bo'ladi.
(A) SWIFT jarayonining bosqichma-bosqich tasviri.(B) (i) Taxminan yarim milliard hujayradan tashkil topgan (iii) OBB to'qima matritsasini hosil qilish uchun siqilgan, taxminan (ii) 2,5 ml EB-asosidagi OBBlarning keng miqyosli mikroquyruq madaniyati.Masshtab paneli, 300 mkm (i).Masshtab satri, 200 mkm (iii).(C) Rezervuar ostidan kuzatilgan EB matritsasi ichida o'rnatilgan 3D bosib chiqarish orqali qurbonlik siyohini (qizil) yozishning vaqt oralig'i.(D) EB matritsasi ichida chop etilgan qurbonlik siyohining vertikal chizig'ining oldingi ko'rinishi.O'lchov chiziqlari, 1 mm (C va D).(E) Quyidagilardan tashkil topgan turli OBB matritsalari uchun SWIFT jarayoniga misollar: (i) EBs, (ii) miya organoidlari va (iii) yurak sferoidlari.1-qator: xarakterli belgilarga ega individual OBBlar.2 va 3-qatorlar: OBB turlarining mos ravishda immuno-bo'yalgan bo'laklari va yorqin maydon tasvirlarining ko'ndalang kesimlari [(D) ning chiziqli chiziq bilan ko'rsatilgandek].Masshtab chiziqlari, 50 mkm (yuqori qator) va 500 mkm (o'rta va pastki qatorlar).(F) SWIFT orqali EB matritsasida spiral (tomir) xususiyatni yaratish: (i) tizimning SAPR tasviri va (ii) EB matritsasi ichida qurbonlik siyohining mos keladigan tasviri va (iii) o'rnatilgan tasvirlar ketma-ketligi Qurbonlik siyohini 3D bosib chiqarish (chapda), inkubatsiyadan keyin qurbonlik siyohini evakuatsiya qilish (o'rtada) va bosilgan spiral tomir kanallari orqali vosita (ko'k bo'yalgan) yordamida to'qimalarning perfuziyasi.
Biz iPSC'larni yopishtiruvchi madaniyatda o'stiramiz va ularni SWIFT uchun katta hajmdagi (> 1 ml) EB hosil qilish uchun ularni keng miqyosli mikroquduq massivlariga o'tkazamiz. O'rim-yig'imdan so'ng, bu EB'lar to'g'ridan-to'g'ri OBB sifatida ishlatilishi mumkin (1A-rasm) yoki yanada farqlash mumkin. qiziqtirgan maxsus organoidlarga.Har bir SWIFT konstruksiyasi uchun biz 400 000 tagacha OBB ekib, yigʻib oldik, ular keyinchalik 0° dan 4°C gacha boʻlgan kollagen I va Matrigeldan tashkil topgan moslashtirilgan ECM eritmasi bilan aralashtiriladi.Ushbu ECM yechimi o'tkazuvchan qon tomir kanallarini yaratish uchun juda mos keladi, chunki uning past haroratlarda suyuqlikka o'xshash harakati quyma va o'rnatilgan bosib chiqarishni osonlashtiradi.Biroq, SWIFT konstruksiyasi 37°C da inkubatorga joylashtirilganidan so'ng, ECM eritmasi gellanishdan o'tadi va siyohni olib tashlash va to'qimalarning keyingi perfuziyasini osonlashtirish uchun sezilarli darajada qattiqlashadi (3, 4).Sovuq OBB-ECM atalasi 200 million hujayra/ml hujayra zichligida deyarli yarim milliard hujayrani o'z ichiga olgan tirik to'qimalar matritsasi (hajmi 2,5 ml) hosil qilish uchun santrifüjlash orqali siqiladi (1B-rasm).Sovuq, siqilgan OBB-ECM atalasi qurbonlik uchun jelatin siyohni o'rnatilgan 3D bosib chiqarish uchun etarli yordam beradi, bu qiziqish tomir kanallari (lar)i uchun shablon bo'lib xizmat qiladi.SWIFT paytida biz to'qima matritsasining tarjima silindrsimon nozuldan taxminan 1 mm oldinda chiqishini va uning ortidan o'z-o'zidan tiklanishini bevosita kuzatdik (1C-rasm, S1-rasm va S1 filmi).O'z-o'zidan tiklanadigan xatti-harakati tufayli, tarjima qiluvchi nozul tirik to'qimalar matritsasi ichida yoriqlar kabi nuqsonlarni keltirib chiqarmaydi.SWIFTdan so'ng to'qima konstruktsiyasi 37 ° C ga qadar isitiladi.Qurbonlik jelatin siyohi eriydi va olib tashlanadi va to'qima konstruktsiyasiga o'rnatilgan quvurli kanallar tarmog'ini qoldiradi.Olingan to'qimalar darhol tashqi nasosga ulanadi va hujayra hayotiyligini saqlab qolish uchun kislorodli muhitda perfuziya qilinadi.
SWIFT keng doiradagi OBBlardan tashkil topgan tirik matritsalarga tomir kanallarini kiritish uchun ishlatilishi mumkin.Misol uchun, biz patentlangan qon tomir kanallarini uchta alohida OBB matritsalariga bosib chiqardik: siqilgan EBs, miya organoidlari (differensiallanishning 21 kunidan keyin) va asosiy yurak fibroblastlari bilan aralashtirilgan iPSC-dan olingan kardiyomiyositlarni o'z ichiga olgan yurak sferoidlarini urish (1-rasm, D va E). ).SWIFT ularning murakkab mikroarxitekturasiga salbiy ta'sir ko'rsatmaydi, bu matritsalardagi individual miya organoidlari ichida buzilmagan qorinchaga o'xshash tuzilmalar mavjudligidan dalolat beradi (rasm S2, A va B).Isitilgandan so'ng, bosilgan to'qima atrofdagi ECM tomonidan quvvatlanadi (rasm S2C).Erkin shaklli tabiatini hisobga olgan holda, SWIFT-dan deyarli o'zboshimchalik bilan qon tomir tarmoqlarini naqshlash uchun foydalanish mumkin, bu EB-ga asoslangan matritsada chop etilgan va perfuziyalangan 3D spiral strukturasi tomonidan ta'kidlangan (1F-rasm va S2 filmi).
SWIFT bioishlab chiqarish usuli OBB asosidagi matritsalar dastlab siyohni qurbon qilish uchun yozishni ta'minlash uchun zarur bo'lgan o'z-o'zini davolovchi, viskoplastik javobni ko'rsatishini, so'ngra siyohni olib tashlashni osonlashtirish uchun matritsaning keyingi qattiqlashishini talab qiladi (2-rasm) (26).Bizning OBB matritsasi dizaynining muhim komponenti qattiqligi yuqori haroratga bog'liq bo'lgan muhandislik ECM hisoblanadi.Yuqorida tavsiflangan protokolga muvofiq, EBlarning deyarli monodispers populyatsiyasidan (o'rtacha diametri 212 mkm va o'zgarish koeffitsienti 4,7%) tashkil topgan sovuq OBB-ECM shlammasi yaratiladi (2A-rasm).Siqilgandan so'ng, hosil bo'lgan to'qimalar matritsasi thy ~10 Pa kesishish rentabelligi stressi bilan kuchli kesish harakati namoyon bo'ldi (2B-rasm va S3-rasm).2°C da saqlansa, to'qima matritsasi qattiq reaksiyaga ega bo'ladi, ya'ni platoni saqlash moduli (G', ~200 Pa) yo'qotish modulidan (G˝, ~50 Pa) oshadi.Qurbonlik jelatin siyohi shunday ishlab chiqilganki, uning kesishish kuchlanishi (ty, ~400 Pa) matritsadan (2B-rasm) (22, 26) hech bo'lmaganda kattaroq kattalikda bo'lib, kerakli silindrsimon filamentlarni hosil qilish imkonini beradi. ko'p yo'nalishli tarzda naqshlangan bo'lishi kerak.Chop etish paytida to'qima matritsasi ichidagi suyuqlikka o'xshash ECM uning reologik harakatiga minimal hissa qo'shadi (rasm S3, B va C).Matritsada zich qadoqlangan OBBlar bo'lmasa, sovuq ECM eritmasi (2°C da saqlanadi) o'rnatilgan 3D bosib chiqarish uchun mos bo'lmagan sof yopishqoq javobni (ē, ~1 Pa) ko'rsatdi (21).Biroq, to'qima matritsasini bosib chiqarish va 37 ° C ga qizdirish bilan uning plato siljish elastik moduli (G') taxminan uch darajaga oshib, 280 kPa qiymatiga etadi (2C-rasm va S3D-rasm), chunki ECM ta'sir qiladi. zich qadoqlangan OBBlar orasidagi interstitsial bo'shliqni egallagan fibrillar jelni ishlab chiqarish uchun termal jelatsiya.Yuqorida aytib o'tilganidek, to'qimalar matritsasining qattiqligining sezilarli darajada oshishi qurbonlik siyohini olib tashlash paytida uning strukturaviy yaxlitligini saqlab qolishga va keyingi perfuziya paytida bosimga asoslangan oqimni qo'llab-quvvatlashga imkon beradi.Nazorat sifatida biz siqilgan EBlarning reologik xususiyatlarini o'lchadik (ECM yo'q) va uning qattiqligi 2 ° dan 37 ° C gacha qizdirilganda sezilarli darajada oshishini aniqladik.Bundan farqli o'laroq, sof ECM bir xil sharoitlarda taxminan ikki kattalik darajasida 110 Pa qiymatiga qadar tez qattiqlashadi (S3E-rasm).Shunday qilib, to'qima matritsasi tarkibini va qurbonlik siyoh reologiyasini moslashtirib, biz tomir kanallarini SWIFT orqali istalgan ixtiyoriy yo'nalishda chop etish imkonini beruvchi tizimni ishlab chiqdik (2D-rasm).Buni ko'rsatish uchun biz 250 mkmlik nozul yordamida 400 mkm dan 1 mm gacha silliq o'zgaruvchan diametrli o'rnatilgan kanallarni naqsh qildik, ular orqali qurbonlik siyoh doimiy hajmli oqim tezligida va o'zgaruvchan bosib chiqarish tezligida yotqiziladi (2E-rasm).Kanal diametrida yuqori chegara bo'lmasa-da, 400 mkm dan past bo'lganlarni yuqori aniqlik bilan bosib chiqarish mumkin emas, chunki ularning o'lchamlari OBB ning xarakterli diametriga (d) yaqinlashadi, bu holda ~ 200 mkm.Kichikroq EBlar SWIFT paytida yuqori funksiyali rezolyutsiyani ta'minlagan bo'lsa-da, yaratilgan EB matritsasi hajmi belgilangan miqdordagi mikroquduq massivlari uchun d3 ga kamayadi.Baholangan chop etish tezligi uchun (0,5 dan 4 mm/s gacha) shtutser tomonidan berilgan kesish kuchlanishi 2Eii-rasm va 1-rasmda ko'rsatilganidek, hujayraning hayotiyligiga yoki matritsa yaxlitligiga salbiy ta'sir ko'rsatmaydi.S4.O'rnatilgan kanal xususiyatlari, shuningdek, shoxlangan tomir tarmoqlarini hosil qilish uchun uzluksiz ulanishi mumkin (S5-rasm).Biz shuni ta'kidlaymizki, to'qima matritsasining viskoplastik tabiati, shuningdek, zich OBB asosidagi siyohlarni qurbonlik siyohiga o'xshash uning ichida bevosita chop etish imkonini beradi.Oddiy misol sifatida, biz siqilgan lyuminestsent oqsildan tashkil topgan siyohni bosdik - EBni ifodalovchi yovvoyi tipdagi (flüoresan bo'lmagan) EBlardan tashkil topgan to'qima matritsasiga spiral naqsh shaklida (S6-rasm).
(A) EB matritsalarini shakllantirish uchun foydalaniladigan EB ning o'lchamdagi taqsimoti (n = 413 EB).(B) (i) Kesish tezligining funktsiyasi sifatida ko'rinadigan yopishqoqlik va (ii) kesish saqlash (yopiq markerlar) va yo'qotish modullari (ochiq markerlar) EB matritsasi va qurbonlik jelatin siyohining kesish stressi funktsiyasi sifatida.(C) EB matritsasi va qurbonlik jelatin siyohining plato saqlash modullariga (yoki yo'qotish moduli yulduzcha bilan ko'rsatilgan) harorat ta'siri.(D) 0,5, 1, 2 va 4 mm/s chop etish tezligida (i) gorizontal va (ii) vertikal xususiyatlarni (tomir shablonlari) SWIFT bosib chiqarish.(E) Chop etish tezligining lümen diametriga ta'siri (i) yorqin maydon va (ii) vertikal bosilgan kanallar kontekstida yashovchanlik bo'yalgan tasvirlar va (iii) qon tomirlari uchun chop etish tezligining funksiyasi sifatida lümen (kanal) diametri gorizontal va vertikal SWIFT bosib chiqarish orqali o'rnatilgan andozalar.Xato chiziqlari SD ni bildiradi (n = 4).O'lchov chiziqlari, 2 mm (D va E).EthD-1, etidium homodimer-1.
Hujayra hayotiyligini aniqlash uchun biz o'rnatilgan tomir kanallari va to'qimalarning atrofi bo'ylab kislorodli muhitning aylanishini ta'minlaydigan perfuzion kamerada perfuziyali EB asosidagi to'qimalarni ishlab chiqardik (3A-rasm va S7-rasm).Nazorat sifatida biz o'tkazmaydigan EB asosidagi to'qimalarni ("kanal yo'q" deb ataladi) tashladik va faqat bir xil kamerada uning atrofi bo'ylab ommaviy axborot vositalarini oqib chiqdik (3A-rasm, tepa).Nazorat to'qimasida (kesim, 4,2 mm dan 4,2 mm) 12 soat ichida jonli, metabolik faol hujayralar (kaltsein-atsetoksimetil (AM) ester bo'yalishi uchun) tor "band" (~ 0,8) bilan cheklangan nekrotik yadro paydo bo'lganligini aniqladik. mm qalinligi) to'qimalarning periferiyasida (3B-rasm va S8-rasm).Bundan farqli o'laroq, EB ga asoslangan perfuzion to'qimalarning luminal perfuziyasi butun to'qimalarda hujayra hayotiyligini kuchaytirdi (3B-rasm).Ularning yuqori hujayra zichligi ushbu matritsalar ichida alohida EB yadrolarini tasvirlashni qiyinlashtirdi (S4-rasmga qarang).Shunday qilib, biz to'qimalarning yashovchanligi to'g'risidagi ma'lumotni bir xil EB'lardan tashkil topgan avaskulyar to'qimalarning to'liq kesimi uchun olingan qiymat bilan normallashtirilgan chegaralangan kaltsein signalining (yashovchan hujayralar) chegaralangan yadro signaliga (jami hujayralar) nisbati asosida xabar qildik (1-rasm). 3Biv).Shunisi e'tiborga loyiqki, xuddi shunday hujayra hayotiylik ko'rsatkichlari dastlab (t = 0 soat) perfuziyalangan va bo'lmagan (nazorat) to'qimalarda (S8-rasm) hatto bosilgan lümenga ulashgan EBlarda ham kuzatiladi, bu SWIFT jarayonining hech qanday salbiy ta'siri yo'qligini ko'rsatadi (1-rasm). S4).Shuningdek, biz normoksik (21% O2, 5% CO2) yoki giperoksik (95% O2, 5% CO2) muhitining perfuziyasiga duchor bo'lgan to'qimalarda (3Biv-rasm) xuddi shunday hujayra hayotiylik qiymatlarini ko'rsatganligini aniqlaymiz.
(A) SWIFT bosib chiqarishdan keyin to'qimalarning hayotiyligini baholash uchun ishlatiladigan perfuzion tizim.(B) (i) kanali yoʻq yoki (ii) normoksik (21% O2) yoki (iii) giperoksidlangan (95% O2) muhit bilan perfuziyalangan toʻqimalarning 12 soatlik kulturadan soʻng yashovchanligini boʻyash va tahlil qilish. (iv) normallashtirilgan hayotiylikni miqdoriy aniqlash.O'lchov chiziqlari, 500 mkm.Xato chiziqlari SD ni bildiradi (n = 4).Chiziqli chiziqlar tashqi perfuziyadan kelib chiqadigan hayotiy hududlarni ta'kidlaydi."Faqat yadro" mintaqasi eng ichki chiziq ichida joylashgan hududga to'g'ri keladi.(C) Kirish va chiqish trubalariga ulangan siqilgan EB-ga asoslangan to'qimalar matritsasi ichida tarmoqlangan, ierarxik tomirlar tarmog'ining o'rnatilgan 3D bosib chiqarishini ko'rsatadigan tasvir ketma-ketligi, to'qimalarga chap va o'ng tomondan kirib ko'rinadi.O'lchov paneli, 10 mm.(D) 12 soatlik perfuziyadan so'ng perfuziyalanuvchi to'qima konstruktsiyasining tasviri (yuqorida) va to'qimalarning turli qismlarida LIVE/O'LIK (yashil/qizil) hujayra hayotiyligi dog'larining floresan tasviri (pastki).Chiziqli chiziq avaskulyar nazorat uchun ekvivalent yashovchanlik chuqurligini ifodalaydi, faqat tashqi tomondan perfuziya qilinadi, qarang (Bi).O'lchov chiziqlari, 1 mm (E va F).(E) lümen endotelizatsiyasi uchun bifurkatsiya kanalining SWIFT bosib chiqarishi.(F) HUVEC hujayralarining perfuziyasidan o'tayotgan evakuatsiya qilingan kanal (oq chiziqli chiziqlar bilan ta'kidlangan).O'lchov paneli, 1 mm.(G va H) HUVEC endoteliyasining VECad-musbat monoqatlamining shakllanishi.Masshtab chiziqlari, 500 mkm (G) va 50 mkm (H).
SWIFT bioishlab chiqarish jarayonini kengaytirish uchun biz perfuziya uchun bitta kirish va chiqish joyiga ega (qalinligi 4 mm) maxsus shakldagi qolipni yaratdik (S9-rasm) va uni ~400 000 dan tashkil topgan 2,5 ml siqilgan EB-ECM shlami bilan to'ldirdik. EBs va jami 0,5 milliard hujayra.Keyin biz oqimni taqsimlash va to'qima matritsasi bo'ylab doimiy devor kesish stressini saqlab qolish uchun mo'ljallangan tarvaqaylab ketgan, ierarxik kanal tarmog'ini chop etdik (3C-rasm va film S3).Chop etishdan so'ng, to'qima konstruktsiyasi isitiladi, qurbonlik siyoh chiqariladi va natijada paydo bo'lgan kanallar 250 mkl / min oqim tezligida giperoksigenlangan vosita (95% O2, 5% CO2) bilan perfuziya qilinadi.12 soatlik doimiy perfuziyadan so'ng, o'rnatilgan tomir kanallari patent bo'lib qoldi va to'qimalar biroz qisqaradi (3D-rasm, tepada), chunki qo'shni OBBlar birlashadi va qayta shakllanadi.3Bii va iii-rasmda ko'rsatilgan kichikroq to'qimalarga (hajmi 0,2 ml) o'xshab, bu katta hajmdagi perfuziyali to'qimalarning hujayralari (hajmi 2,5 ml) kaltsenning floresansi bilan ko'rsatilgandek, 4 mm qalinligining ko'p qismida hayotiy bo'lib qoladi. AM (3D-rasm, pastki).
Biz ushbu SWIFT konstruksiyalarida endoteliy bilan qoplangan kanallarni hosil qilish uchun inson kindik venasi endotelial hujayralarini (HUVEC) kiritdik.Xususan, endotelial hujayralar SWIFT konstruksiyasi doirasida o'rnatilgan, bifurkatsiyalanuvchi tomirlar tarmog'i (3-rasm, E dan H va S4 filmi) orqali birinchi navbatda HUVEC suspenziyasini (107 hujayra/ml) perfuziya qilish orqali urug'lanadi.Hujayralarning luminal yuzasiga yopishishiga ruxsat berildi.20 soatlik perfuziyadan so'ng biz shaffof bo'lmagan to'qimalarni bo'ylama bo'ylab kesib tashladik va to'g'ridan-to'g'ri endotelizatsiyalangan lümenni tasvirladik.Endotelial hujayralar tomir endotelial kaderin (VECad) bo'yalishi (3-rasm, G va H) bilan ko'rsatilganidek, luminal yuzaning ba'zi qismlarida xarakterli tosh tosh naqshini hosil qilsa-da, ularning qoplanishi to'liq emas edi.Bizning doimiy harakatlarimiz ushbu bosilgan tomir kanallari ichida birlashuvchi endoteliy ishlab chiqarishga qaratilgan.
SWIFT-ni yanada ko'rsatish uchun biz inson iPSC-dan olingan yurak OBBlarini o'z ichiga olgan funktsional, perfuziyali to'qimalarni yaratdik (4-rasm).Uning miqyosliligi tufayli biz EB dan boshlanadigan va hujayra madaniyati muhitiga kichik molekulalarni qo'shish orqali Wnt yo'lini modulyatsiya qiladigan o'sish omilisiz suspenziya madaniyati protokolini moslashtirdik (27), bu strategiya yuqori samaradorlik bilan kardiomiotsitlarni beradi (2-rasm). 4, A dan D gacha) (28).Ushbu protokoldan foydalanib, biz 79 ± 6% kardiomiotsitlarni (yurak troponin T-musbat, cTnT+) va 19 ± 6% stromal hujayralarni (cTnT−, Vimentin+) o'z ichiga olgan 6 ml gacha (siqilgandan keyin) yurak OBBlarini (S5 filmi) hosil qildik. ) (4D-rasm va S10-rasm).Ushbu OBBlar bizning ishlab chiqilgan ECM va inson neonatal dermal fibroblastlari (HNDFs) bilan aralashtirib, keyinchalik yurak to'qimasi matritsasi hosil qiluvchi santrifüj orqali siqilgan atala hosil qildi (S11-rasm).Siqilgandan so'ng, yurak matritsasining taxminiy hujayra zichligi 240 million hujayra / ml va kardiyomiyosit zichligi 180 million hujayra / ml (4E-rasm).Kichkina disk shaklidagi qolipga aylanganda, bu yurak OBB konstruktsiyasi dastlab asinxron tarzda uradi, kaltsiy to'lqinlari bir kunlik (1-kun) perfuziyadan so'ng sporadik va xaotik tarzda tarqaladi (S12-rasm va S6 filmi).Biroq, madaniyatda 7 kundan keyin (7-kun) to'qima konstruktsiyasi to'qima bo'ylab ritmik va tez tarqaladigan kaltsiy to'lqinlari bilan o'z-o'zidan va sinxron ravishda uradi (rasm S12 va film S6).
(A) Yurak organoidlarini farqlash protokoli.(B) Kardiyak troponin T va 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ning 9-kuni bitta yurak OBBda bo'yalishi. O'lchov chizig'i, 50 mkm.(C) Kardiyak troponin T, a-aktinin va DAPIning 9-kuni bitta yurak OBBda bo'yalishi. O'lchov chizig'i, 10 mkm.(D) iPSC-dan olingan kardiyak OBBda yurak sferoid tarkibi.Kardiyomiyositlar (CM) yurak troponin T-musbat (cTnT+) va stromaga o'xshash hujayralar (strom.) cTnT−/Vimentin+ sifatida aniqlanadi.(E) Siqilgan yurak OBB to'qimalarida hujayra zichligi.(F) Yurak toʻqimasi matritsasiga shoxlangan tomir kanallarining joylashishi, evakuatsiyasi va perfuziyasini koʻrsatuvchi tasvir ketma-ketligi (toʻqima oʻlchamlari: ustki eni 6 mm; pastki eni 4,2 mm; chuqurligi 4,2 mm va balandligi 12 mm) .O'lchov chiziqlari, 2 mm.(G) 24 soatlik perfuziyadan so'ng SWIFT yurak to'qimalarining (ko'ndalang kesimi) hayotiyligini bo'yash.O'lchov paneli, 500 mkm.(H) 8 kunlik perfuziyadan so'ng SWIFT yurak to'qimalarida cTnT, a-aktinin va DAPI bo'yalishi, bu sarkomerik remodelingni ko'rsatadi (o'q uchlari).Masshtab paneli, 10 mkm.(I) Vaqt o'tishi bilan ortib borayotgan amplitudani ko'rsatadigan kardiomiotsitlarning o'z-o'zidan qisqarishi tufayli ankrajli moslashuvchan tirgaklarning vertikal siljishi.8-kuni kardiyomiyositlarning kontraktilligini oshirish uchun muhitga 2 mM kaltsiy qo'shiladi ("d8 + Ca").(J) SWIFT yurak to'qimalarining o'z-o'zidan qisqarishi va elektr chastotasi (1 va 2 Gts) o'rtasidagi langar joy almashish naqshini solishtirish.(K) 10 mkM izoproterenolni yuborishdan oldin va keyin spontan qisqarish shakli.(L) Izoproterenol bilan davolashda o'rtacha qisqarish chastotasi.(M) 1 mM 1-geptanolni yuborishdan oldin va keyin spontan qisqarish shakli.(N) 1-geptanol bilan davolashda eng yuqori cho'qqigacha qisqarish amplitudasi.(O) Oddiy inson yuragining 3D SAPR modeli, shu jumladan, chap oldingi tushuvchi arteriya segmenti va diagonal novda, Milliy Sog'liqni saqlash institutidan yuklab olingan 3D Print Exchange (qo'shimcha septal va diagonal shoxchalar qo'lda qo'shilgan, pushti ).(P) 3D kompyuter tomografiyasi maʼlumotlari yordamida 1:2 masshtabli polidimetilsiloksan qolipi hosil boʻladi va LAD arteriyasi diagonal va septal (oʻq uchlari) shoxlari bilan birga old devor xanjariga [(O)dagi sariq qism] ichiga oʻrnatilgan. SWIFT orqali yurak to'qimalarining matritsasi.O'lchov paneli, 5 mm.
Keyinchalik, biz ushbu yurak OBB matritsasi ichiga dallanadigan kanal arxitekturasini joylashtirdik, evakuatsiya qildik va perfuziya qildik (4F-rasm va S7 filmi).Tahlil qilish uchun bir nechta namunalarni yaratish uchun biz oddiy to'qimalar konstruksiyalarini ishlab chiqdik, ularning har birida bitta bosilgan kanal mavjud bo'lib, ular 500 mkl / min yorug'lik oqimi bilan to'ldirilib, ~ 0,8 din / sm2 o'rtacha kesish stressiga olib keladi.Har bir T shaklidagi to'qima pastki qismidagi kirish trubkasi bilan bog'langan va to'qimalarni barqarorlashtirishga xizmat qiladigan va vaqt o'tishi bilan uning qisqarishi va urishini kuzatish imkonini beruvchi bir juft ankraj tirgaklari orqali yuqoriga o'rnatilgan (rasm S13, A va B).1 kunlik perfuziyadan so'ng, ommaviy to'qimalar hayotiyligicha qoldi (4G-rasm).8 kunlik davr mobaynida yurak to'qimasi keng tarqalgan sarkomerik arxitekturani rivojlantirdi (4H-rasm va S13, C va D-rasm).Xuddi shu davrda to'qimalarning umumiy kontraktilligi 20 baravardan ko'proq oshdi, bu ankraj tirgak harakatining amplitudasi (4I-rasm, S13B-rasm va S8 filmi) tomonidan tasvirlangan.Muhitga 2 mM kaltsiy qo'shganda urish qobiliyatini ~ 40% oshirishga erishiladi.8-kuni to'qima bo'limining qarama-qarshi tomonlarida muvofiqlashtirilgan qisqarish naqshlari tomonidan taklif qilinganidek, urish sinxronizatsiyasi ham ortdi (S14-rasm).O'z-o'zidan qisqarishga qo'shimcha ravishda, to'qima to'qimalarning har ikki tomonida joylashgan bir juft platina elektrodlari orqali tez stimulyatsiyaga javob berdi (4J-rasm va S8 filmi).
SWIFT biomahsuloti tomonidan ishlab chiqarilgan yurak to'qimalarining konstruksiyalarining funktsional ishlashini yanada tavsiflash uchun biz b-adrenergik retseptorlari uchun selektiv bo'lmagan agonist bo'lgan izoproterenolni o'rnatilgan kanal orqali 10-5 M konsentratsiyasida perfuziya qildik, bu esa o'z-o'zidan urishning ikki baravar oshishiga olib keldi. chastotasi (4-rasm, K va L).Shuningdek, biz 1 mM konsentratsiyada bo'shliqni blokirovka qiluvchi 1-geptanolni perfuziya qildik va ularning kontraktil amplitudasining qisqarishini kuzatdik (4-rasm, M va N).Yakuniy namoyish sifatida biz Milliy Sog'liqni Saqlash Instituti (NIH) 3D Print Exchange (4-rasm, O va P) dan mavjud bo'lgan bemorga xos, yurak strukturaviy ma'lumotlaridan foydalangan holda yurak OBB matritsasi ichida arterial tomirlar tarmog'i geometriyasini chop etdik.Biz 1:2 miqyosda miokardning xanjarini takrorlash uchun 3D bosilgan qolipdan foydalandik va qolipni siqilgan yurak OBB matritsasi bilan to'ldirgandan so'ng, chap oldingi tushuvchi (LAD) koronar arteriya geometriyasini takrorlash uchun SWIFT dan foydalandik. oldinga, keyin septalga o'tadi va yurak to'qimalarining tashqi chetiga qo'shni yotadi.
SWIFT bioishlab chiqarish usuli bemorga xos hujayralardan tashkil topgan otolog to'qimalarni ishlab chiqarish uchun iPSC-dan olingan OBBlardan tashkil topgan zich hujayrali matritsalardan foydalanadi.Bu usul o'zboshimchalik bilan hajm va shakldagi o'ziga xos organga xos to'qimalarni kengaytiriladigan tarzda yaratishga imkon beradi.Biz taxmin qilamizki, katta hajmdagi (100 ml) perfuzatsiya qilinadigan OBB asosidagi to'qimalar o'rnatilgan tomir kanallari tarmog'i bilan naqshlangan bo'lishi mumkin.Biroq, terapevtik dasturlar uchun ushbu organga xos to'qimalarning muvaffaqiyatli tarjimasi qo'shimcha yutuqlarni talab qiladi.Masalan, iPSC-dan olingan organoidlar uchun joriy protokollar etarli hujayra kamolotiga va mikrovaskulyar tarmoq shakllanishiga ega bo'lmagan OBBlarni beradi.Shunday qilib, SWIFT yurak to'qimalarida kattalardagi yurak to'qimalarida kuzatilgan kontraktillikka (~20% kuchlanish) nisbatan faqat oddiy kontraktillik (~1% kuchlanish) kuzatiladi (29).Biz hozirda to'qimalar funksiyasini, shu jumladan kontraktillikni yanada kuchaytirish maqsadida anizotrop yurak OBBlarini yaratishga e'tibor qaratmoqdamiz.Bundan tashqari, biz yangi protokollarni qabul qilishni nazarda tutamiz, masalan, buyrak organoidlari uchun yaqinda xabar qilinganlar (19), ular yanada etuk, mikrovaskulyarizatsiyalangan OBBlarni yaratish yo'lini taklif qiladi.Shu bilan bir qatorda, SWIFT uchun kattalar to'qimalaridan yig'ib olingan birlamchi hujayra sferoidlaridan tashkil topgan tirik matritsalar yordamida to'qimalar funksiyasini yaxshilash mumkin. Organ muhandisligi sohasi jadal rivojlanmoqda.Misol uchun, yaqinda boshqa tadqiqotchilar an'anaviy "jeldagi hujayralar" yondashuvidan foydalangan holda katta yurak shaklidagi konstruktsiyani o'rnatilgan 3D bosib chiqarish haqida xabar berishdi.Ushbu ish katta e'tiborga sazovor bo'lsa-da, bu to'qimalar uzoq muddat davomida in vitro perfuziya qilinmagan va ularning hujayra hayotiyligi va kontraktil funktsiyasi haqida xabar berilmagan (30).
Xulosa qilib aytganda, biz SWIFT deb nomlanuvchi yangi bioishlab chiqarish usulini namoyish qildik, u iPSC-dan olingan OBB to'qimalarining matritsalaridan foydalanadi, ular zarur hujayra zichligi, mikroarxitekturasi va mahalliy to'qimalarga yaqinlashadigan funksiyasini namoyish etadi.SWIFT keng qamrovli OBBlar, jumladan EBlar, differentsial organoidlar va ko'p hujayrali sferoidlar bilan amalga oshirilishi mumkin.Bizning usulimiz terapevtik ilovalar uchun o'rnatilgan tomir kanallari bilan shaxsiylashtirilgan organga xos to'qimalarni yaratish uchun yangi yo'llarni ochadi.
Shaxsiy Genom loyihasi 1 (PGP1) iPSC'lari yoki barcha EB-dan olingan yurak OBB protokollari uchun BJFF iPSC'lar (Vashington universitetida S. Jain tomonidan taqdim etilgan) Matrigel bilan qoplangan plitalarda (Corning Life Sciences) o'stirilgan va mTeSR1 muhitida (STEMCELL) saqlanadi. Texnologiyalar).Koloniyalar birlasha boshlagandan so'ng (60-80% qo'shilish), hujayralar kaltsiy yoki magniysiz fosfat tamponli tuz (PBS) bilan yuvildi va 1 ml / 10 sm2 da fermentsiz o'tish eritmasi (ReLeSR, STEMCELL Technologies) qo'shildi. to'qima madaniyati maydoni.ReLeSR darhol aspiratsiya qilindi va kolba 7 daqiqa davomida 37 ° C, 5% CO2 da inkubatsiya qilindi.Koloniyalarni olib tashlash uchun yangi mTeSR1 (1 ml/10 sm2) serologik pipetka yordamida kolbaga muloyimlik bilan qo'shildi va koloniyalarni parchalash uchun asta-sekin bir marta qayta pipetlandi.Keyin hujayralar yangi tayyorlangan Matrigel bilan qoplangan kolbaga qo'shildi, 1: 8 va 1: 3 oralig'ida bo'linishni amalga oshirdi va mTeSR1 umumiy hajmi 2 ml / 10 sm2 to'qima madaniyati maydoniga qo'shildi.Hujayralar inkubatorda 37°C/5% CO2 darajasida saqlangan.
Majburiy yig'ish yo'li bilan ko'p sonli (>105) bir xil EB yaratish uchun mikroquduq qator plitalari ishlatilgan.Asosiy kengligi 400 mkm bo'lgan teskari piramidalar ko'rinishidagi mikro quduqlar oltitali plastinka formatida joylashtirilgan va polidimetilsiloksan (PDMS) qoliplash orqali ishlab chiqarilgan.Quymalarni parchalashni osonlashtirish va polimerlar o'rtasida quyma mosligini ta'minlash uchun quyidagi jarayon ishlatilgan.Qisqacha aytganda, SYLGARD 184 (Dow Corning) oʻzaro bogʻlovchi bilan 10:1 nisbatda aralashtirildi va sotuvda mavjud boʻlgan mikroquduq plastinkasiga quyildi, vakuum kamerasida gazsizlandi va mikroquduqlarning salbiy quyma hosil qilish uchun 80°C da 2 soat davomida quritildi. .Keyinchalik, Ecoflex 00-30 (Smooth-On Inc.) SYLGARD 184 uchun bo'lgani kabi quyish, gazsizlantirish va quritishning o'xshash usuliga rioya qilib, ijobiy qolipni yaratish uchun ishlatilgan. Smooth-On Inc.) poliuretan-salbiy qolipni yaratish uchun Ecoflex musbat ustiga quyildi.Keyinchalik, ~80 g SYLGARD 184 8 g o'zaro faoliyat bog'lovchi bilan planetar mikserda aralashtiriladi, poliuretan manfiy qolipga quyiladi, vakuumda 10 daqiqa davomida gazsizlanadi va xona haroratida 24 dan 48 soatgacha qotib qoladi. .Sog'langan SYLGARD 184 poliuretan qolipidan olib tashlanishidan oldin to'liq o'zaro bog'lanishni ta'minlash uchun 80 ° C haroratda 2 soatdan ortiq pechga joylashtirildi.
Mikroquduq massivlarini hujayra madaniyati uchun tayyorlash uchun massivlar 1 soat davomida izopropil spirtiga botirildi va keyin suvga botirildi va 1 soat davomida avtoklavga solindi.Hujayralarni tayyorlashdan oldin darhol avtoklavlangan suv quduqlardan to'kilgan, so'ngra ular steril bir quduqli patnisga (Omnitray, Falcon) joylashtirilgan.Keyin quduqlardan tutib qolgan havo pufakchalarini olib tashlash uchun quduqlarni 2000 g da 5 daqiqa santrifüj qilishdan oldin har bir quduqqa 1,5 ml AggreWell Rinsing Solution (ARS; STEMCELL Technologies) qo'shildi.ARS aspiratsiya qilindi va quduqlar 2 ml Dulbecco modifikatsiyalangan Eagle muhiti (DMEM) bilan ikki marta yuvildi.Nihoyat, DMEM 10 mkM ROCK inhibitori (ROCKi; Y27635; EMD Millipore) bilan to'ldirilgan 3 ml EB madaniyat muhiti (EBCM) bilan almashtirildi va mikrowell massivlari xona haroratida saqlangan.EBCM tayyorlash uchun mTeSR1 1:50 nisbatda polivinil spirti (PVA) eritmasi bilan aralashtirib, 4 mg/ml eritma hosil qildi.Penitsillin-streptomitsin 100 U / ml ga qo'shildi va eritma steril filtrdan o'tkazildi va 2 haftagacha 4 ° C da saqlanadi.PVA eritmasi xona haroratida aralashtirib, 80 ml deionlangan suvga 20 g PVA (30 dan 70 kDa; Sigma-Aldrich) qo'shilishi bilan tayyorlangan.Uzluksiz aralashtirish ostida, PVA ni suvda to'liq eritish uchun eritma harorati 80 ° C ga ko'tarildi, shundan so'ng PVA eritmasi foydalanishga tayyor bo'lgunga qadar 4 ° C da saqlanadi.
EBs hosil qilish uchun PGP1 iPSC'lar Matrigel bilan qoplangan 225 sm2 T225 flakonlarida (Falcon) 60-80% qo'shilish darajasigacha o'stirildi.PGP1 xujayralarining bitta T225 odatda har birida ~ 4200 mikroquduqni o'z ichiga olgan 24 quduq (to'rtta oltitali plastinka) ekish uchun ishlatilgan.Substratdan iPSClarni olib tashlash uchun hujayralar avval kaltsiy yoki magniysiz PBS da yuvildi va asosan bitta hujayrali suspenziya hosil qilish uchun Accutase (Innovatsion Cell Technologies) da 37 ° C da 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi.Hujayralar oldindan isitiladigan DMEM/F12 va Hepesga qo'shildi va 220 g da 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi.Supernatant olib tashlandi va hujayralar EBCM va 10 mkM ROCKi da qayta suspenziya qilindi.Hujayralar LIVE/DEAD tasvirlash tizimi yordamida hisoblangan va 1 ml hujayra suspenziyasi har bir chuqurchaga hujayra zichligida taxminan 500 hujayradan iborat.Keyin quduq plitalari hujayralarni siqish uchun 100 g da 3 daqiqa davomida santrifüj qilindi.24 soatdan keyin hujayra muhiti ROCKi ni olib tashlash uchun 4 ml yangi EBCM bilan almashtirildi.Keyin quduq plitalari kuniga ikki marta yarim media o'zgartirildi (2 ml EBCM yangi vosita bilan almashtiriladi).Muhitni o'zgartirganda ehtiyot bo'lish kerak edi, chunki ular EB'larni alohida mikro quduqlaridan bezovta qilmaslik uchun asta-sekin qo'shiladi va olib tashlanadi.4 kunlik kulturadan so'ng, jami sakkizta oltita quduqli mikroquduqli plitalar ~1 ml OBB shlamini hosil qilish uchun etarli hajmdagi EB hosil qilishi mumkin.
Miya organoidlarini hosil qilish uchun PGP1 iPSCs ~ 80% qo'shilish darajasiga o'stirildi va 0-kuni 12 daqiqa davomida yumshoq hujayra dissotsiatsiyasi reagenti bilan inkubatsiya qilish orqali Matrigel bilan qoplangan T225 flakonlaridan ko'tarildi.Kolbalar tarkibida Hepes bo'lgan DMEM/F12 bilan yuvildi va 220 g da 5 daqiqa davomida santrifüj qilindi.Keyinchalik, hujayralar EBCM va 10 mkM ROCKi da qayta suspenziya qilindi va yuqorida aytib o'tilganidek, har bir mikroquyruq uchun taxminan 500 hujayra zichligida tayyorlangan va 100 g 3 daqiqa davomida santrifüjlash orqali siqilgan mikroquduq massivlariga ekilgan.Media 1-kuni ROCKisiz yangi EBCM bilan almashtirildi.2-kuni, EB diametri taxminan 200 mkm bo'lib o'lchandi va media GlutaMAX bilan DMEM / F12, 1: 1000 geparin (10 mg / ml; Sigma-Aldrich) dan tashkil topgan neyron indüksiyon muhiti (NIM) bilan almashtirildi. ), 1:100 N-2 qoʻshimchasi (Thermo Fisher Scientific) va 1× minimal muhim oʻrta muhim boʻlmagan aminokislotalar (MEM-NEAA) (Thermo Fisher Scientific) 1:2000 10 mM SB431542 dimetil sulfoksid (DMSO) (SB) , EMD Millipore) va DMSO (LDN, EMD Millipore) da 0,2 mM LDN 193189 dan 1:2000.SB va LDN alikotlari -20 ° C da saqlangan va hujayralarga NIM qo'shilishidan oldin darhol boshqa media komponentlariga qo'shilgan.3-kuni, OBBlar 15 mM Hepes buferini o'z ichiga olgan DMEM/F12 bilan yuqoriga va pastga pipetlash orqali mikro quduqlardan chiqarildi va agregatlar 50 ml lik santrifüj naychasiga o'tkazildi.OBBlarning tortishish kuchi ostida joylashishiga ruxsat berildi, supernatant aspiratsiya qilindi, so'ngra OBBlar yig'ib olingan ikkita mikroquduq massiviga 6 ml NIMda qayta suspenziya qilindi.Keyinchalik, ular ishlov berilmagan T25 kolbalariga ekildi va 6 ml NIM har bir kolbaga OBB bilan aralashtirildi.O'rim-yig'imdan so'ng, har bir kolbaga qo'shimcha 5 ml NIM pipetlendi.Kolbalar 60 rpm ga o'rnatilgan va inkubatorga joylashtirilgan orbital silkitgichga (VWR Shaker, 1000 Standard) o'tkazildi.5 va 7-kunlarda kolbalar kolbani 45° haroratda ushlab turadigan, hujayralar T25 kolbasining bir burchagiga joylashishi uchun maxsus qurilgan sedimentatsiya tokchasiga joylashtirish orqali almashtirildi.Cho'ktirilgandan so'ng, supernatant aspiratsiya qilindi va 6 ml yangi NIM bilan almashtirildi.8-kuni muhit neyrobazal muhit (Thermo Fisher Scientific), 1:200 N-2 qo'shimchasi (Thermo Fisher Scientific) bilan 1:1 DMEM/F12 aralashmasidan tashkil topgan neyron farqlash muhiti (NDM) bilan almashtirildi, 1: A vitaminisiz 100 B27 (Thermo Fisher Scientific), 1:4000 insulin eritmasi (Sigma-Aldrich), 1:100 GlutaMAX va 1:200 MEM-NEAA.B-merkaptoetanolning 1000 × eritmasi (1: 1000; Thermo Fisher Scientific) ommaviy axborot vositalarini OBBlarga qo'shishdan oldin darhol NDMga qo'shildi.Shundan so'ng, ommaviy axborot vositalari har kuni almashtirildi va 21-kuni SWIFT vaskulyarizatsiyasi uchun miya organoidlari yig'ib olindi.
1, D va E va shakl uchun ishlatiladigan yurak sferoidlarini yaratish uchun.S2, biz Lian va boshqalar tomonidan oldingi protokolni moslashtirdik.(28).Qisqacha aytganda, PGP1 iPSC'lar mTeSR1 muhitida T225 plitalarida 80 dan 95% gacha bo'lgan birikmaga o'stirildi.Kardiyak differentsiatsiya muhiti 500 ml RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) ni insulinsiz 10 ml B27 (kardiyomiyositlar differentsiatsiyasi muhiti, CDM hosil qilish uchun) yoki 10 ml B27 (kardiomiotsitlar etilish muhitini hosil qilish uchun, CMM) bilan birlashtirish orqali tayyorlangan.0-kuni mTeSR1 muhitini 24 soat davomida CDM va 6 mM CHIR99021 ga almashtirish orqali farqlash boshlandi.Keyin quyidagi media o'zgarishlar kiritildi: 1-kun, CDM;3-kun, CDM va 2 mM iWR1 (BioGems; CDMI);5 va 7 kunlar, CDM;9-kun (yoki urish kuni bo'yicha), CMM;11 va 13 kunlar, 2% B27 bilan to'ldirilgan glyukozasiz RPMI (kardiyomiyositlarni tozalash uchun);va 15-kun, CMM.Alohida T225 kolbada birlamchi qorincha normal inson yurak fibroblastlari (Lonza) stromal hujayra o'sish muhitida (Lonza) yetishtirildi.Keyinchalik, kardiyomiyositlar, 17-kuni va fibroblastlar PBS bilan yuvish orqali o'tkazildi va keyin TrypLE bilan 9 daqiqa (kardiyomiyositlar uchun) yoki 5 daqiqa (fibroblastlar uchun) 37 ° C da inkubatsiya qilindi.Keyinchalik, TrypLE 37 ° C DMEM yordamida yuvildi va hujayralar 220 g 5 daqiqa davomida santrifüjlash orqali alohida 15 ml li naychalarga pellet qilindi.Ikkala hujayra turi ham 10% homila sigir zardobi (FBS) va penitsillin-streptomitsin (100 U/ml) o'z ichiga olgan yuqori glyukozaga ega DMEM (Amerika tipidagi madaniyat to'plami) dan iborat yurak sferoid muhitida (CSM) qayta suspenziya qilindi.Hujayralar hisoblab chiqildi va 70% kardiyomiyositlarda va 30% fibroblastlarda birlashtirildi, so'ngra har bir mikroquyruq uchun 2000 hujayra zichligida shakllangan 800 mkm diametrli PDMS mikroquyruklariga ekildi.Hujayralardan OBB hosil qilish uchun mikroquduq massivlari 100 g da 3 daqiqa davomida santrifüj qilindi.CSM har kuni yarim o'zgartirildi va yurak sferoidlari yig'ilgandan keyin 2 dan 4 kungacha urishi kuzatildi, shu nuqtada ular SWIFT vaskulyarizatsiyasi uchun yig'ib olindi.
Ushbu jarayonning ko'p qirraliligini ko'rsatish uchun biz (27) va (28) ga moslashtirilgan protokolga muvofiq yurak OBBlarini ham yaratdik.BJFF iPSC'lari yuqorida ta'riflanganidek -4-kuni EB ga aylantirildi.Ikkita T225 (~80% qo'shilishda) to'rtta olti quduqli mikroquduqlarni ekish uchun ishlatilgan.ROCKi ni olib tashlash uchun 3-kuni media 4 ml EBCM bilan almashtirildi.2-kuni ikkita quduqdan EBlar yig'ib olindi, birlashtirildi va tortishish ostida joylashishiga ruxsat berildi.Supernatant aspiratsiya qilindi va ikkita quduqdagi EBlar 12 ml EBCMda qayta suspenziya qilindi va bitta ishlov berilmagan T25 kolbasiga o'tkazildi.Shunday qilib, to'rtta olti quduqli plitalardan (ya'ni, jami 24 quduq) EBlar yig'ib olindi va 12 T25 kolbalariga joylashtirildi.Ushbu kolbalar aylanish tezligi 60 rpm bo'lgan orbital shakerda inkubatsiya qilingan.T25 shishalaridagi hujayralarni saqlash va farqlash uchun quyidagi muhit o'zgarishlari amalga oshirildi: kun -1, 12 ml EBCM;0 va 1 kunlar, 10 ml CDM va 5 mkM CHIR99021 (BioGems) (CDMC);2-kun, 10 ml CDM;3 va 4 kunlar, 10 ml CDMI;va >5 kun, har kuni 10 ml CDM.0, 2 va 5-kunlarda oldingi muhitdan o'sish omillarini yoki kichik molekulalarni olib tashlashni kuchaytirish uchun hujayralar o'zgartirilayotgan muhitdan 4 ml foydalanib, aspiratsiyadan so'ng chayish amalga oshirildi.Hujayralar joylashtirgandan so'ng, yangi madaniyat muhiti qo'shilishidan oldin chayqash muhiti olib tashlandi.Kaltaklanish odatda 7-kunida kuzatilgan va deyarli barcha yurak OBBlari 9-kunga kelib sezilarli darajada urishgan. 9 va 11-kunlar orasida SWIFT bosib chiqarish yurak OBBlari yordamida amalga oshirildi, shundan so'ng hujayralar CMMda saqlanadi.
ECM prepolimer jeli quyidagicha tayyorlandi: Transglutaminaza (TG) ishchi eritmasi avval hujayra madaniyat muhitiga (EBs uchun mTeSR1, miya organoidlari uchun NIM) mikrob to'qimalarining TG formulasini (20 mg/ml; Moo Gloo TI) qo'shish orqali tayyorlandi. va eritmani 0,2 mkm shpritsli filtr orqali steril filtrlash.Kardiyak OBB uchun TG ECMga qo'shilmagan.Keyinchalik, yakuniy ECM eritmasida (umumiy hajm, y millilitr) kollagen konsentratsiyasini (4 mg / ml) yaratish uchun zarur bo'lgan yuqori konsentratsiyali kalamush dumi kollagen I (Korning) hajmi (x millilitr) hisoblab chiqilgan.ECM prepolimer gel eritmasi (0,825y - 1,135x) ml mTeSR1, 0,125y ml TG ishchi eritmasi (agar mavjud bo'lsa), x/10 ml 10 × PBS, y/100 ml 250 mM CaCl2, ~ x dan tashkil topgan. /40 ml 1 N NaOH, x mililitr yuqori konsentratsiyali kalamush dumi I turdagi kollagen va 0,04 y ml Matrigel muz ustiga qo'shildi.Masalan, kollagen I eritmasi (8,90 mg/ml) yordamida 8 ml ECM prepolimer gelini hosil qilish uchun quyidagi tartibda qo'shildi: 2,56 ml mTeSR1, 1 ml mTeSR1 tarkibida TG (20 mg/ml), 0,36 ml 10× PBS, 0,080 ml CaCl2, 0,090 ml 1 n NaOH, 3,596 ml kollagen I va 0,320 ml Matrigel.NaOH miqdori, kerak bo'lganda, yakuniy pH ~ 7,4 ga erishish uchun o'zgartirildi.Erta gellanishning oldini olish uchun pipetka kollagen va Matrigelni pipetlashdan oldin muzli PBS yordamida oldindan sovutilgan.Barcha komponentlarni qo'shib, aralashtirgandan so'ng, havo pufakchalarini olib tashlash uchun jel 2000 g da 3 minut davomida 2 ° C da santrifüj qilindi.ECM prepolimer jeli muz ustida saqlangan va ~1 soat ichida ishlatilgan.
SWIFT uchun qurbonlik siyohini tayyorlash uchun jelatin eritmasi ishlatilgan.15% (w/w) jelatin eritmasi asta-sekin 45 g jelatinni 255 ml PBS ga kaltsiy yoki magniysiz 85 ° C da aralashtirganda qo'shish orqali tayyorlangan.Xuddi shu protokol haroratiga rioya qilgan holda perfuziya kameralarida ishlatiladigan to'qima qoliplarini chop etish uchun alohida jelatin siyoh yaratildi, bundan tashqari 70 ° C haroratdan foydalanildi.Har bir holatda, namunalar jelatinni to'liq eritish uchun haroratda ushlab turildi va 12 soat davomida aralashtirildi, shundan so'ng ularning pH 2 N NaOH yordamida ~ 7,5 ga o'rnatildi.Har bir issiq jelatin eritmasi steril filtrlangan, alikotlangan va 4 ° C da 6 oygacha saqlangan.
EB lar diametri 200 dan 250 mkm gacha o'sgandan so'ng (mikro quduq madaniyatida odatda 2 dan 4 kungacha) P1000 pipetka uchi bilan quduqlarda yuqoriga va pastga kuchli pipetleme orqali yig'ib olindi.EB o'z ichiga olgan muhit 50 ml li naychaga o'tkazildi, har oltita quduq uchun bitta naycha.Quduqlar DMEM/F12 va Hepesning ortiqcha miqdori bilan 10 ml serologik pipetka yordamida EBlarning ko'p qismini (>90%) olib tashlash uchun yuvildi.To'xtatilgan EBlari bo'lgan vosita 50 ml lik santrifüj naychalariga qo'shildi va EB 10 daqiqa davomida muz ustida inkubatsiya qilish orqali joylashishiga ruxsat berildi.Barcha keyingi hujayralarni qayta ishlash ECM jellanishini oldini olish uchun muz ustida amalga oshirildi.Supernatant aspiratsiya qilindi va EBlar bitta 50 ml li naychaga yig'ildi.Keyinchalik, bitta hujayralarni yuvish uchun 50 ml yangi DMEM/F12 va Hepes qo'shildi.Keyin EB larning yana 10 daqiqa turishiga ruxsat berildi, so'ngra supernatant aspiratsiya qilindi va EBs DMEM/F12 va Hepes yordamida 15 ml gacha qayta suspenziya qilindi va 15 ml li naychaga o'tkazildi va 10 daqiqa davomida cho'kishiga ruxsat berildi. .Keyinchalik, EB'larni siqish uchun 15 ml li naycha 100 g da 2 ° C da 3 daqiqa davomida santrifüj qilindi, supernatant aspiratsiya qilindi va EB matritsasining umumiy hajmi taxmin qilindi.Hujayradan tashqari bo'shliqdagi DMEM/F12 va Hepesni ECM bilan almashtirish uchun hujayralar P1000 pipetkasi bilan pipetlash orqali 1:3 (EB matritsasi: ECM eritmasi) hajm nisbatida ECM eritmasida yuvildi va keyin 100 g da santrifüj qilindi va supernatant aspiratsiya qilindi.Nihoyat, konsolidatsiyalangan EB-ECM eritmasi bir xil hajmdagi ECM eritmasida qayta suspenziya qilindi va keyingi bosqichlarda ishlov berilishi va pipetlanishi mumkin bo'lgan zich EB-ECM atalasini hosil qildi.OBB matritsasining hujayra zichligini baholash uchun EB-ECM shlammasi Eppendorf trubkasida 3 daqiqa davomida 150 g santrifüj qilindi va OBB matritsasi hajmi balandlikka mos keladigan ikkinchi Eppendorf trubasiga ma'lum hajmdagi suvni pipetkalash orqali vizual tarzda baholandi. birinchi naychadagi granulaning.Keyinchalik, EB'lar 15 daqiqa davomida yumshoq hujayra dissotsiatsiyasi reagentida inkubatsiya qilish va P1000 pipetkasi bilan trituratsiya qilish orqali bitta hujayralarga ajratildi va umumiy hujayra soni hisoblandi.Keyin OBB matritsasining hujayra zichligi hujayra sonining OBB matritsasi hajmiga nisbati bilan baholandi.
Reologik o'lchovlar avval tayyorlangan EB, ECM va EB-ECM shlamlarini (EBsning o'rtacha diametri, ~200 mkm) 3 sm3 shpritslarga (Nordson EFD) siqib, so'ngra ularni to'g'ridan-to'g'ri TA reometr plastinkasiga ekstrudirovka qilish orqali amalga oshirildi. -asboblar Discovery HR-3 kuchlanish bilan boshqariladigan reometr.Diametri 25 mm bo'lgan plastinka 2 ° C ga oldindan sovutilgan.Devorning sirpanishini oldini olish uchun plastinka va disk ham zımpara bilan qoplangan va bo'shliq balandligi 1 mm ga yetkazilgan.Ushbu o'lchovlardan oldin har qanday ortiqcha atala spatula bilan kesilgan.Birinchidan, tebranish chastotasini tozalash 0,5 Pa qo'llaniladigan kesish stressi bilan 0,1 dan 10 rad / s gacha amalga oshirildi. Keyinchalik, tebranish amplitudasini tozalash 0,5 Gts chastotada 0,01 dan 100 Pa gacha amalga oshirildi.Ko'rinadigan yopishqoqliklar 0,01 dan 5 / s gacha bo'lgan siljish tezligidan amalga oshirilgan oqimni tozalash orqali aniqlandi.EB matritsasining rentabellik stressi ortib borayotgan siljish tezligiga Gerschel-Bulkley egri chizig'ini moslashtirish orqali baholandi.Keyinchalik, haroratni ko'tarishda ECM jellanishini o'lchash uchun saqlash va yo'qotish modullari haroratni 37 ° C ga ko'tarishdan va haroratni pasaytirishdan oldin 2 ° C da 5 Pa tebranish siljish stressi va 0,5 Gts chastotasi bilan tekshirildi. gelatsiyadan keyin EB matritsasining qisqarishini hisobga olish uchun bo'shliq balandligi 900 mkm.Jelatin siyoh reologiyasini o'lchash uchun qurbonlik siyoh 0,5 sm3 shisha shpritsda (Gamilton) tayyorlangan va ichki diametri 250 mkm (Nordson EFD) bo'lgan 1,5 dyuymli tekis metall nozul orqali ekstruziya qilingan.Chop etilgan jelatin yig'ilib, yuqorida aytib o'tilganidek, o'rnatilgan reometrga o'tkazildi.
To'g'ridan-to'g'ri siyoh yozuvi ommaviy to'qimalarni bosib chiqarish va parfüz qilish uchun moslashtirilgan silikon qoliplarni ishlab chiqarish uchun ishlatilgan.Birinchidan, SE1700 asosi: qattiqlashtiruvchi vosita (Dow Corning) ning 10:1 massa nisbatini birlashtirib, keyin 1% (g/a) qora silikon pigmentni (Silc-Pig, Smooth-On) qo'shish orqali chop etiladigan silikon siyoh tayyorlandi.Keyin komponentlar 2000 aylanish tezligida 3 daqiqa davomida mikser yordamida aralashtirildi (THINKY Inc.).Spatuladan foydalanib, yangi aralashtirilgan silikon siyoh 30 sm3 shpritsga (Nordson EFD) solingan va tiqilib qolgan havoni olib tashlash uchun >3000 g santrifüj qilingan.Shpritsning chiqishiga 0,41 mm ichki diametrli uchi (Nordson EFD) bo'lgan konusli nozul biriktirilgan va shprits maxsus 3D printerga (26) biriktirilgan.Murakkab shpritsdan Ultimus V bosim regulyatori (Nordson EFD) tomonidan ishlab chiqarilgan bosim orqali pastki shisha taglik ustiga chiqarildi.To'qimalarining qoliplari silikon devorlardan va quvurlarni kiritish joylari, ya'ni kirish va chiqish joylari uchun kichik kanallardan iborat.Chop etilgandan so'ng, har bir qolip qattiqlashishi uchun 80 ° C ga > 2 soat davomida o'tkazildi.Qattiqlashgandan so'ng, qolipning yuqori qatlamiga yangi silikon siyoh ekstruziya qilindi (qo'lda yoki 3D printer yordamida) va tepaga ikkinchi shisha slayd qo'shildi, shunda silikon qistirma ikkita shisha slaydlar orasiga yopishtirilgan.3-rasmda qo'llanilgan qolip uchun shaffof silikon bosilgan va yig'ilishdan oldin ikkinchi shisha slaydga qattiqlashtirilgan, shunday qilib yig'ilgan qistirmaning yuqori tomonining o'rtasida ko'krakni kiritish uchun tirqish bor edi.Silikonni davolash uchun mog'or 80 ° C ga o'tkazildi.Ichki diametri 0,83 mm bo'lgan zanglamas po'latdan yasalgan quvurlar perfuziya uchun ishlatiladigan qoliplarning kirish / chiqish kanallariga o'rnatildi va ichki diametri 1/32 dyuym bo'lgan Versilon silikon quvurlari tashqi qismga o'rnatildi. quvurlarning uchlari va kirish va chiqish joylarini yopish uchun shlang qisqichi bilan kıvrılır.3-rasmdagi maxsus perfuzion mog'or uchun zanglamaydigan po'latdan yasalgan naychalar bosilgan tomir kanallari va trubadan uzluksiz ulanishni osonlashtirish uchun bir uchiga kesilgan kichik ~ 1 mm chuqurchaga ega edi.Qoliplar avtoklavlangan va ishlatishdan oldin xona haroratida saqlangan.
Shu bilan bir qatorda, polikarbonat xonalari va old va orqa plitalar maxsus perfuzion asboblarni ishlab chiqarish uchun ishlov berildi (rasm S7).Shisha oynalardan foydalanish to'qimalarni vizualizatsiya qilish imkonini berdi va oynalar va kamera devorlari o'rtasida o-ringlar orqali suv o'tkazmaydigan muhrlar hosil bo'ldi.Suyuqlik kirish va chiqish joyi bo'lib xizmat qiluvchi metall quvurlar kameraning yon va pastki qismiga mahkam o'rnatildi.Perfuzion kameralar avtoklavlangan va ishlatishdan oldin xona haroratida saqlangan.OBB asosidagi matritsalar ichidagi tomir kanallarini chop etishdan oldin, E-Shell 300 shaffof qatronidan foydalangan holda stereolitografiya 3D printeri (Perfactory Aureus, Envisiontec. Inc.) yordamida langar tuzilmasi chop etildi, ultrabinafsha (UV) yorug'lik ostida sozlangan va ichki qismga joylashtirilgan. kamera.Ushbu tuzilma to'qimalarning ichiga joylashtirish uchun bir juft ankraj tirgaklariga ega bo'lib, ular perfuziya paytida to'qimalarni ushlab turishga xizmat qilgan va shu bilan birga to'qimalarning tashqi yuzalari atrofida vosita perfuziyasini ta'minlaydi.Keyinchalik, to'qimalarning shablonini (oxir-oqibat to'qimalarning shaklini hosil qiluvchi) stereolitografik tarzda chop etildi, ultrabinafsha nurlanishida qotib qo'yildi, plazma bilan ishlov berildi va Pluronic F-127 (Sigma) ning 10% (w/w) suvli eritmasiga botirildi va havoda quritishga ruxsat beriladi.Ushbu Pluronic F127 bilan qoplangan shablon kameraga o'rnatildi va mahkamlash tirgaklari ustiga o'rnatildi.Keyin, 15% (w/v) jelatin eritmasiga PBS qo'shib tayyorlangan 5% (w/v) eritilgan jelatin kameraga quyiladi va yon metall naychalarga AOK qilindi va shablon atrofida jelatinga ruxsat berildi. 15 daqiqa davomida 4 ° C.Keyin shablonni to'g'ridan-to'g'ri tortib olib, maxsus to'qima geometriyasiga ega bo'lgan to'qima qolipi va uning tepasida langar tirgaklari chiqib ketdi.Qolipning pastki qismida joylashgan to'qima kirish trubkasi atrofida o-ring qo'yildi, shundan so'ng printer kameraga moslashtirildi.Kirish joyi atrofida to'qimalarni biriktiruvchi vilka hosil qilish uchun yuqorida tavsiflangan ECMga o'xshash yuqori konsentratsiyali ECM (hcECM) eritmasi tayyorlandi, lekin kollagen (7,5 mg / ml) va 2% (w/v) TG [dan muhitda TG (160 mg/ml) zahirasi].Ushbu material 22 ° C da 15 daqiqa davomida jelleşmeden oldin to'qima mog'orining tagida va O-ring atrofida tarqatildi.Nihoyat, qolipni SWIFT bosib chiqarish uchun siqilmagan hujayra agregati va ECM eritmasi bilan to'ldirishdan oldin pastki metall pinga 5% (w/v) erigan jelatin yuborildi.
Oddiy 17 yoshli yurakning 3D kompyuter quvvatli dizayni (SAPR) modeli NIH 3D Print Exchange'dan stereolitografiya (.stl) fayli ko'rinishida yuklab olindi.Model dastlab cho'qqini pastga yo'naltirish uchun aylantirildi va miyokardning bir qismi Tinkercad (Autodesk) yordamida raqamli ravishda kesildi.Keyin geometriya MeshLab-da model yuzasining shovqini va asperliklarini bartaraf etish uchun muqobil ravishda tekislandi va soddalashtirildi.Keyinchalik Tinkercad kerakli geometriyaning ijobiy va salbiy modellarini yaratish va oldingi devor va septum bo'limida, LAD koronar arteriya yaqinida, keyinchalik yurak uchun rezervuar bo'lib xizmat qilgan xanjarni raqamli ravishda o'yib chiqarish uchun ishlatilgan. OBB matritsasi.Ushbu modellar 1:2 miqyosda Objet30 3D printeri (Stratasys) yordamida yurakni vizualizatsiya qilishning yakuniy modeli va yurak to'qimasini qabul qilish uchun mo'ljallangan usta sifatida qurilgan.Ushbu uch bosqichli jarayon shaffof PDMS blokini (SYLGARD 184 da 10:1 asosda: davolovchi vosita) kesilgan miyokard ustasining tashqi yuzasidan quyish, ochiq rangli PDMS yordamida haqiqiy kesilgan miyokardni quyishdan iborat edi. (SYLGARD 184 da qizil va oq Silc-Pig yordamida) va bu ikki qismni PDMS bilan yig'ish elim vazifasini bajaradi va qorinchalarni to'ldiradi.Yurak to'qimalarining xanjar rezervuari ochiq bo'lishini ta'minlash uchun davolash bosqichida 3D bosilgan xanjar vilkasi ishlatilgan.Chop etish yo'li LAD va uning diagonal shoxlaridan birini asl SAPR modelidan ajratib olish orqali yaratilgan.Stereolitografiya fayli kesildi va tomir kanallarini skeletizatsiya qilish va uni GCode ga aylantirish uchun MATLAB dasturidan foydalanildi.SAPR modelining past rezolyutsiyasi tufayli bemor ma'lumotlaridan LADning faqat bir qismi va bitta diagonalni olish mumkin edi;qo'shimcha septal va diagonal novdalar in vivo jonli ravishda topilganlarga o'xshash geometriyalardan foydalangan holda koronar tomirlarni bosib chiqarish yo'liga qo'lda qo'shildi.
Qon tomir tarmoqlarini o'rnatilgan 3D bosib chiqarishni yoqish uchun yuqorida tavsiflangan protsedura yordamida qurbonlik uchun jelatin siyoh tayyorlandi.Jelatin eritmasi (yuqorida aytib o'tilganidek, 85 ° C da eriydi) 80 ° C da <30 daqiqa davomida eritildi va keyin 5% (w/v) eritma hosil qilish uchun PBSda suyultirildi.Keyinchalik, bosilgan siyohni vizualizatsiya qilish uchun qizil oziq-ovqat bo'yoqlari 2% (v/v) qo'shildi.Yangi tayyorlangan qurbonlik uchun jelatin siyoh 0,5 sm3 hajmli shisha shpritsga solingan va keyin gelatsiyani qo'zg'atish uchun 15 daqiqa davomida 4 ° C ga sovutilgan.Keyin shisha shprits 3D printerga o'rnatilgan maxsus ishlab chiqarilgan shprits nasosiga yuklangan.Shprits pompasi Arduino mikrokontrolleri va step-motorli haydovchi tomonidan boshqarildi.Shprits bochkasi, taxminan 20 ° C haroratni saqlab, jelatin siyohining qattiqligini nazorat qilish uchun suv bilan sovutilgan, maxsus qurilgan harorat sozlagichiga joylashtirilgan.Shpritsning pastki qismiga uzunligi 1,5 dyuym va ichki diametri 0,25 mm (Nordson EFD) bo'lgan metall nozul o'rnatildi.Chop etishdan oldin shprits harorat bilan boshqariladigan korpusida >15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi.
OBB-ECM matritsasi silikon qoliplarga yoki perfuziya kameralariga yuklandi va SWIFT tugagunga qadar sovuq bo'lib qolishi va ECM jelleşmesini ta'minlash uchun quyidagi qadamlar tezda bajarildi.Birinchidan, yurak to'qimasini ishlab chiqarish uchun yurak OBB hajmi 100 g ga santrifüjlash orqali siqilgan holda baholandi.Keyinchalik, ECM eritmasi 107 HNDF xujayrasi / ml yurak OBBlari bilan ECM: HNDF hujayra aralashmasidagi yurak OBBlarini qayta suspenziya qilishdan oldin, atala hosil qilish uchun aralashtirildi.Yangi tayyorlangan OBB shlami qoliplarga pipetlangan va qoliplar va ularning korpusi agregatlarni siqish uchun 150 g da 2°C da 3 daqiqa santrifuga qilingan va ~2,4 × 108 ± 0,4 × 108 hujayradan iborat OBB asosidagi matritsa hosil qilgan. / ml va 6 × 105 ± 2 × 105 HDNF hujayralari / ml.Supernatant ECMning ko'p qismi OBBlarning siqilgan to'shagining tepasida ~ 1 mm ECM eritmasini qoldirib olib tashlandi.3-rasmda (C va D) uzoq vaqt bosib chiqarish vaqtida matritsani salqin saqlash uchun qolip maxsus tayyorlangan suv bilan sovutilgan metall plastinkaning old tomoniga o'tkazildi, bu metall plastinkadan iborat bo'lib, akril plita bilan qoplangan. muzdek suv oqib o'tadigan maydalangan kanallar bor edi.Bosib chiqarish jarayonini ko'rishni osonlashtirish uchun orqa yoritishni ta'minlash uchun metall plastinka ham, akril varaq ham kesilgan.Qolip suv bilan sovutilgan plastinkada bir juft qisqich bilan ushlab turilgan va uni ikkita metall uchburchak prizmalariga bosib vertikal yo'nalishda korpusida ushlab turilgan.
Keyin kerakli tomir tarmog'i OBB asosidagi matritsa ichida 0,5 dan 4 mm / s gacha bo'lgan bosib chiqarish tezligida chop etildi.Shprits pompasining ekstruziya tezligi ma'lum diametrli filamentni aniqlash uchun o'rnatildi.Qon tomirlari geometriyasi maxsus qurilgan MATLAB skriptida ishlab chiqilgan bo'lib, u tarmoqlangan kubik splinelarni yaratdi, nozulning ilgari bosilgan xususiyatlar orqali tarjima qilinishini oldini olish uchun avtomatik ravishda chop etish tartibini tayinladi va har bir egri chiziqni GCode-da bo'lak-bo'lak chiziqli segmentlar sifatida ko'rsatdi.Filamentning (va shuning uchun kanalning) diametrini o'zgartirish uchun doimiy siyoh cho'kmasini saqlab, bosib chiqarish tezligi o'zgartirildi.Har bir chiziq segmentidan so'ng, siyoh ekstruziyasi to'xtatiladi va bosilgan naqshlarni qo'zg'atmaslik uchun, nozul to'qimalarning yuqori qismidan vertikal ravishda tortiladi, yangi x va y koordinatalariga tarjima qilinadi va pastga siljitish orqali to'g'ri yangi z koordinatasiga qayta kiritiladi. vertikal.
Murakkab ierarxik tomirlar tarmog'ini shablonlashda (3-rasm, C va D) kanal diametrlari ularning diametridan qat'i nazar, tarmoqning har bir segmentida ekvivalent kesish kuchlanishini ta'minlash uchun hisoblab chiqilgan.Puazeyl oqimini faraz qilib, quyidagi tenglamalar to'plamini yechish orqali kanal radiusi R va Q oqimini har bir tugundagi bosim P bilan birga aniqladik (MATLABda).Massani saqlash asosida tugunga keladigan oqim yig'indisi nol∑iQi=0 ga teng.
3-rasmda (C va D) tasvirlangan qon tomir tarmog'i uchun eng katta tomirlar (kirish va chiqish) va eng kichik o'rtasidagi nisbat 1,3 ga teng ekanligi aniqlandi.Ushbu kanallarni doimiy yotqizish tezligida chop etish uchun nozul tezligi har bir kanal diametrining kvadratiga (yoki uning tasavvurlar maydoniga) teskari proportsional ravishda modulyatsiya qilingan.
Yurak to'qimalarini qayta ishlangan perfuziya kameralarida SWIFT bosib chiqargandan so'ng, uzoq muddatli madaniyat uchun ochiqlikni saqlash uchun zarur bo'lgan mexanik barqarorlikni ta'minlash uchun to'qimalar hcECM bilan qoplangan.Keyin mog'or OBB-ECM matritsasining jelatsiyasini yakunlash va to'qimalarni o'rab turgan bosilgan qurbonlik jelatin filamentlari va jelatinni eritish uchun 45 daqiqa davomida 37 ° C, 5% CO2 inkubatoriga o'tkazildi.Inkubatsiyadan so'ng, silikon qoliplar avtoklavlangan SE1700 silikon asosining ortiqcha qismi (o'zaro bog'lovchisiz) orqali qolipning yuqori qismidagi bo'shliqqa yopilgan, ishlov berilgan perfuzion kameralar esa polikarbonat qopqog'ini vidalash orqali muhrlangan.Keyin muhrlangan perfuzion qurilmalar to'qimalarni vertikal va media rezervuariga ulashgan, PVA (4 mg / ml; EB perfuziyasi uchun) yoki CMM (yurak to'qimalari perfuziyasi uchun) bilan mTeSR1 muhitini o'z ichiga olgan maxsus tayyorlangan to'qimalar perfuziyasi korpusiga o'tkazildi. 1% antibiotik-antimikotik bilan (Thermo Fisher Scientific).Keyinchalik, to'qima 37 ° C da saqlanadi, bu erda qurbonlik uchun jelatin siyoh eritiladi va jelatinni olib tashlaydigan va ochiq kanallarni qoldiradigan suyuqlik muhitini kiritish uchun peristaltik nasos (Ismatec Inc.) ishlatilgan.Yurak to'qimalarining perfuziyasi uchun bosilgan jelatinni 0,01 ml / min tomir oqimi tezligida 5 minut davomida evakuatsiya qilgandan so'ng, tashqi perfuzion uchun kirish joyi ochildi va yurak to'qimasini o'rab turgan eritilgan jelatin yuqori perfuziya tezligida evakuatsiya qilindi. (0,8 ml/min) 5 daqiqa davomida.Barcha jelatinni olib tashlashni ta'minlash uchun bu jarayon takrorlandi, ammo qon tomir perfuziya tezligi 0,02 ml / min.~1 soat davomida perfuziya tezligi asta-sekin o'zining yakuniy perfuzion tezligigacha oshirildi.Amaldagi perfuziya tezligi 3-rasm (C va D) uchun 250 mkl/min, yashovchanlikni o'lchash uchun EB-to'qima perfuziyasi uchun 100 mkl/min va yurak to'qimalarining perfuziyasi uchun 500 mkl/min.Muayyan tajribalar uchun muhit rezervuari steril filtrlangan 95% O2/5% CO2 (Airgas Inc.) aralashmasini ~10 ml/min hajmli oqim tezligida muhit orqali pufaklash orqali giperoksidlangan.
EB hayotiyligini o'lchash uchun to'qimalar 12 soatlik perfuziyadan so'ng oqimdan olib tashlandi.Keyinchalik, to'qimalar va ularning mog'orlari avval muzdek sovuq PBSning katta hammomiga botirildi.Perfuzion kameralar old panelni ochish va oyna oynasini olib tashlash orqali ochildi.Keyin to'qimalar mikrodiseksiya qaychi yordamida bo'lindi va aspiratsiya orqali to'qimalarni tasvirlash uchun joylashtirish uchun kesilgan silikon qistirmalari bo'lgan 35 mm Petri idishiga o'tkazildi.Keyinchalik, PBS mTeSR1 va PVA muhitiga (4 mg / ml) yangi mTeSR1 bilan bir vaqtning o'zida hajmning ~ 50% ni qayta-qayta yuvish orqali o'zgartirildi.Keyin teng hajmdagi 2× konsentratli LIVE/DEAD eritmasi [kaltsen (1 mkl/ml), etidiy homodimer-1 (EthD-1, 4 mkl/ml) va Hoechst eritmasi (0,5 mkl/ml)] qo'shildi va to'qima 30 daqiqa davomida 37 ° C da inkubatsiya qilindi.Inkubatsiyadan so'ng, 5 × ApoFluor ob'ektividan foydalangan holda konfokal mikroskopda (ZEISS) LIVE/DEAD tasvirlari olindi.Hujayra sonining normallashtirilgan hayotiylik ko'rsatkichi chegaralangan kalsein-AM yashovchanlik signali maydonining chegaralangan Hoescht signali maydoniga nisbati sifatida hisoblab chiqilgan.Yurak to'qimalari uchun hujayra hayotiyligi ma'lumotlarini olish uchun xuddi shu jarayon ishlatilgan.Biroq, tasvirlash paytida urish artefaktlarini bostirish uchun to'qimalar tasvirlashdan oldin darhol muz ustida inkubatsiya qilingan.
Endotelizatsiyadan oldin, SWIFT bosilgan bitta tomirga ega bo'lgan EB asosidagi to'qima endotelial hujayra yopishishini kuchaytirish uchun 20 daqiqa davomida 1% (v/v) Matrigel bilan to'ldirilgan DMEM: F12 bilan perfuziya qilingan.EGM2 muhitida yetishtirilgan HUVEClar 0,05% tripsin/EDTAda 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilish yo'li bilan kolbalaridan yig'ib olindi.Hujayralar DMEMda 220 g da 10% FBS bilan santrifüj qilindi, suzildi va EGM2 da 107 hujayra / ml zichlikda qayta suspenziya qilindi.HUVEC suspenziyasi lümen orqali 40 mkl/min oqim tezligida ular to'qimadan chiqib ketguncha ko'rinmaguncha perfuziya qilingan.Keyin oqim to'xtatildi va hujayralar lümen yuzasiga joylashishi uchun inkubatorda 10 daqiqa davomida to'qimali prokladka tekis yotqizildi.Bu jarayon uch marta takrorlandi, har safar qistirmani boshqa burchak ostida yotqizdi, shunda lümenning to'rtta kvadranti HUVEClar bilan qoplangan.So'ngra to'qimalar tahlil uchun fiksatsiya qilinishidan oldin 24 soat davomida 40 mkl/min oqim tezligida 1:1 mTSeR1:EGM2 muhiti bilan perfuziyaga qaytarildi.
Rhod-2 ning konsentrlangan eritmasi (Thermo Fisher Scientific) 50 mkg kaltsiy indikatorini 100 mkl DMSOda eritib tayyorlandi.Keyin eritma Tyrode eritmasida (Alfa Aesar) 1:250 nisbatda suyultirildi.Blebbistatin (Sigma-Aldrich) 5 mM yakuniy konsentratsiyada (5 mM eritma eritmasidan) qo'shildi.Kardiyak OBB to'qimalari avval Tyrode eritmasi (Alfa Aesar) bilan yuvilgan va 30 daqiqa davomida kaltsiy indikator eritmasi bilan inkubatsiya qilingan.Keyinchalik, to'qimalar blebbistatin o'z ichiga olgan Tyrode eritmasi bilan bir marta yuvildi.Namunalar 555 nm yorug'lik yoritilishiga duchor bo'ldi va keng maydon signali ilmiy qo'shimcha metall oksidi yarimo'tkazgichli kamera (sCMOS, Andor texnologiyasi) tomonidan ushlandi.Ma'lumotlar Micro-Manager ochiq kodli dasturiy ta'minot yordamida olingan.Ko'rish paytida yurak to'qimalarini o'z ichiga olgan plastinka isitiladigan yostiqning (Stoelting) ustiga qo'yildi.
Perfuzion kamera ichidagi SWIFT yurak to'qimalarini elektr rag'batlantirish uchun orqa panel to'rtburchaklar (14 mm dan 5 mm) ichiga o'ralgan ikkita platina simlari (diametri 0,25 mm) bo'lgan plastinka bilan almashtirildi va ikkala platina simlari ham 15 mm masofada joylashgan. perfuzion kameraga o'rnatilganda bir-biridan ajratiladi.2 ms impulsli monofazik signal 1 yoki 2 Gts chastotada va 6 V/sm amplitudada buyurtma asosida ishlab chiqarilgan Arduino asosidagi kontroller tomonidan yaratilgan.Shaklda yurak OBB to'qimalarining nuqta stimulyatsiyasi uchun.S12 va S6 filmida elektrodlar bir xil platina simlaridan tashkil topgan, ammo ekstremitalar bir-biridan 750 mkm masofada joylashtirilgan va qo'lda mikromanipulyator yordamida stimulyatsiya qilish uchun to'qima yaqinida joylashtirilgan.To'qimalarning tezligini ishga tushirish uchun kuchlanish 20 V ga o'rnatildi.
8-kuni kaltsiy 2 mM yakuniy konsentratsiyaga qadar madaniy muhitga qo'shildi.Videolarni olishdan oldin yurak to'qimalari 20 daqiqa davomida perfuziya qilingan.Keyin, izoproterenol (Sigma-Aldrich) yurak to'qimalariga 20 daqiqa davomida 10 mkM konsentratsiyada, ular qayta tasvirga olinmaguncha, intraluminal tarzda kiritildi.Alohida tajribalar to'plamida 1-geptanol (Sigma-Aldrich) 11-kuni 1 mM konsentratsiyada muhitga qo'shildi va yurak to'qimalari 20 daqiqa davomida intraluminal ravishda perfuziya qilindi, shundan so'ng har bir to'qimalar tasvirga tushirildi.Kaltaklash naqshlari Tracker (physlets.org/tracker) dasturidan foydalangan holda yurak to'qimalarining ankraj tirgaklarini kuzatish orqali olingan.
To'qimalar avval 30 daqiqa davomida 4% formaldegidda mahkamlash orqali kriosektsiya qilindi va keyin 0,05% Tween 20 detarjen (PBST) o'z ichiga olgan PBSda uch marta yuvildi.Ruxsat etilgan to'qimalar 30% saxaroza (saxaroza eritmasi) o'z ichiga olgan PBS da 4 ° C da bir kechada inkubatsiya qilindi va keyin 1 soat 30 daqiqa davomida Optimal kesish harorati birikmasi: saxaroza (OKT: saxaroza) 1: 1 eritmasiga o'tkazildi.Keyinchalik, to'qima muloyimlik bilan kriostat to'qimalarining qolipiga joylashtirildi, keyinchalik u 100% OCT eritmasi bilan to'ldirildi va kriostat Peltier sovutgichida muzlatildi.To'qimalar 40-60 mkm bo'laklar yordamida bo'lindi va Superfrost Plus slaydga (VWR Inc.) o'tkazildi.Bo'limlar immuno-bo'yashdan oldin -20 ° C da saqlangan.
Immunitetni bo'yash uchun to'qimalarning kriyoseksiyalari dastlab 0,5% sigir zardobi albumini (BSA) yoki 2% eshak zardobi (DS) o'z ichiga olgan Triton X ning 0,125% eritmasida 10 daqiqa davomida o'tkazilib, PBSTda uch marta yuvilib, kamida 30 marta blokirovka qilingan. 3% BSA yoki 2% DS o'z ichiga olgan PBS eritmasida min.Keyin birlamchi antikorlar [4 oktyabr (1:200; sc-5279, Santa Cruz Biotechnology), Sox 2 (1:40; AF2018, R&D Systems), Tuj1 (1:1000; MAB1195, R&D Systems), kollagen I (1) :500; ab90395, Abcam), cTnT (1:200; ab45932, Abcam) va sarkomerik a-aktinin (1:200; ab9465, Abcam)] PBSda 3% BSA yoki 2% DSga qo'shildi va bir kechada inkubatsiya qilindi. 4°C.Ertasi kuni birlamchi antikor PBSTda uch marta chayish yo'li bilan olib tashlandi va Alexa Fluor Plus bilan konjugatsiyalangan ikkilamchi antikorlar 1:400 nisbatda 3% BSA yoki 2% DSda PBSda 45 daqiqa davomida qo'shildi.Ikkilamchi antikorlar PBSTda uch marta chayish yo'li bilan olib tashlandi.Keyin yadrolar PBSda 3 minut davomida 4',6-diamidino-2-fenilindolning 1:5000 suyultirilishidan foydalangan holda etiketlendi, so'ngra PBST bilan ikki marta yuvildi.Bo'limlar Zeiss konfokal mikroskopi yordamida tasvirlangan.
Oqim sitometriyasini o'tkazish uchun uning hajmini o'lchagandan so'ng (EB zichligini baholash uchun yuqorida aytib o'tilganidek) yurak OBB matritsasi ECMni olib tashlash uchun sovuq DMEM bilan yaxshilab chayiladi.Qolgan yurak OBBlari papain eritmasida 30 daqiqa davomida 37 ° C da inkubatsiya qilish orqali dissotsiatsiya qilindi [papain (25 U / ml) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga binoan l-sistein va EDTA o'z ichiga olgan Earlning muvozanatli tuz eritmasi (Worthington, Inc.)] .Hujayralar yangi CDMda yuvilgan, P1000 pipetka uchi bilan takroriy pipetlash orqali maydalangan va gemositometr yordamida hisoblangan.Keyin hujayralar 3% BSA o'z ichiga olgan PBSda ikki marta yuvildi, CytoFix (BD Biosciences) bilan 15 daqiqa davomida 4 ° C da inkubatsiya qilish yo'li bilan o'rnatildi va keyin santrifüjlash va 3% BSA o'z ichiga olgan PBS qo'shilishi orqali ikki marta yuvildi.Oqim sitometriyasi uchun 1 × 106 hujayra perm bilan yuvish eritmasida (BD Biosciences) qayta suspenziya qilindi va yangi perm yuvish eritmasida chayishdan oldin xona haroratida 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi.Keyinchalik, namunalar Pharmingen eritmasida (BD Bioscience) inkubatsiya qilish orqali xona haroratida 15 daqiqa davomida bloklandi.Keyin hujayralar etiketli birlamchi antikorlarda 1 soat davomida inkubatsiya qilindi (Vimentin PE, 562337, BD Pharmingen; cTnT Alexa Fluor 647, 565744, BD Pharmingen; Pharmingen eritmasida 1:10 suyultirish).Inkubatsiyadan so'ng hujayralar ikki marta perm yuvishda yuvildi va LSR II Analyzer (BD Biosciences) yordamida tahlil qilindi.Hujayra populyatsiyalarini o'tkazish rasmda ko'rsatilganidek amalga oshirildi.S10.
Ushbu maqola uchun qo'shimcha material http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/5/9/eaaw2459/DC1 manzilida mavjud.
S7-rasm.SWIFT bioishlab chiqarish va to'qimalarga xizmat ko'rsatish uchun perfuzion apparatlarning sxematik rasmlari.
Film S8.SWIFT biomanufacturing tomonidan ishlab chiqarilgan katta yurak to'qimalarining (T-shaklidagi konstruksiya) kontraktil faolligi.
Bu Creative Commons Attribution-notijoriy litsenziyasi shartlariga muvofiq tarqatiladigan ochiq maqola boʻlib, undan istalgan vositada foydalanish, tarqatish va koʻpaytirishga ruxsat beradi, agar natijada foydalanish tijorat maqsadlarida boʻlmasa va asl asar toʻgʻri boʻlsa. keltirilgan.
DIQQAT: Biz faqat sizning elektron pochta manzilingizni so'raymiz, shunda siz sahifani tavsiya qilayotgan odam siz uni ko'rishni xohlayotganingizni va bu keraksiz xat emasligini bilishi uchun.Biz hech qanday elektron pochta manzilini ushlamaymiz.
Biz ildiz hujayralaridan olingan organ qurilish bloklaridan tashkil topgan perfuziyali inson to'qimalarini yaratish uchun bioishlab chiqarish usuli haqida xabar beramiz.
Biz ildiz hujayralaridan olingan organ qurilish bloklaridan tashkil topgan perfuziyali inson to'qimalarini yaratish uchun bioishlab chiqarish usuli haqida xabar beramiz.
© 2019 Amerika fan taraqqiyoti assotsiatsiyasi.Barcha huquqlar himoyalangan.AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef va COUNTER.Science Advances ISSN 2375-2548 hamkori hisoblanadi.
