Hibridación genómica comparativa
# Hibridación genómica comparativa

La hibridación genómica comparativa o CGH (por sus siglas en inglés Comparative Genomic Hybridization) es un método de citogenética molecular para analizar las variaciones en el número de copias (CNV) en relación con el nivel de ploidía del ADN de una muestra en comparación con una muestra de referencia, esto sin la necesidad de realizar un cultivo celular. El objetivo de esta técnica es comparar de manera rápida y eficiente dos muestras de ADN genómico derivado de dos organismos diferentes, que a menudo se relacionan pues se sospecha que tienen diferencias ya sea en la ganancia o pérdida de cromosomas completos o regiones subcromosomales (una porción del cromosoma). Esta técnica originalmente se desarrolló para evaluar las diferencias entre los complementos cromosómicos de un tumor sólido y el tejido normal y tiene una resolución mejorada de 5-10 megabases en comparación con las técnicas tradicionales de análisis citogenéticos de banda como giemsa y FISH, las cuales están limitadas por la resolución del microscopio utilizado.

Esto se logra con el uso de la hibridación competitiva fluorescente in situ. En resumen, implica el aislamiento de ADN de las dos fuentes a comparar, comúnmente la referencia y una muestra, el etiquetado independiente de cada muestra de ADN con diferentes fluoróforos (moléculas fluorescentes) de distintos colores (generalmente rojo y verde), la desnaturalización del ADN para volverlo monocatenario y la hibridación de las dos muestras resultantes en una proporción de 1:1 para una propagación normal de cromosomas en metafase, a los cuales las muestras de ADN marcadas se unirán en su locus de origen. A continuación, las señales fluorescentes de colores se comparan con el uso de un microscopio de fluorescencia y un software, esto a la longitud de onda de cada cromosoma para identificar las diferencias cromosómicas entre las dos muestras. Una mayor intensidad de color proveniente de la muestra de prueba en una región específica de un cromosoma indica la ganancia de material en esa región, mientras que una mayor intensidad de color de la muestra de referencia indica la pérdida de material en la muestra de ensayo en una región específica. Un color neutro (amarillo cuando las etiquetas de fluoróforos son de color rojo y verde) indica que no hay diferencia entre las dos muestras en esa región.

Esta técnica solo puede detectar anormalidades cromosómicas no balanceadas, debido a que las anomalías cromosómicas equilibradas como lo son las translocaciones recíprocas, las inversiones o los cromosomas anillo no afectan el número de copias, que es lo que se detecta por medio de la tecnología CGH. Sin embargo, el CGH permite la exploración de los 46 cromosomas humanos en una sola prueba y la detección de deleciones y duplicaciones, en escala microscópica lo que puede conducir a la identificación de genes candidatos para estudiarlos más a fondo mediante otras técnicas citológicas.

Mediante el uso de microarreglos de ADN en conjunto con la técnica de CGH, se desarrolló un arreglo más específico (aCGH), que permite medir la variación del número de copias locus por locus con una resolución mayor como lo son 100 kilobases. Esta técnica mejorada permite descubrir la etiología de condiciones conocidas y desconocidas.

## Historia

La motivación para el desarrollo de la CGH deriva del hecho de que las formas disponibles de análisis citogenético de bandeo en el momento (Giemsa y FISH) estaban limitadas en su potencial de resolución por los microscopios necesarios para la interpretación de los resultados. Además, la interpretación de bandas giemsa suele ser ambiguo y por lo tanto su fiabilidad es baja, estas técnicas requieren bastante mano de obra lo que limita los loci a examinar.

En 1992 Kallioniemi y sus colegas reportaron el primer análisis de CGH en la Universidad de California, en San Francisco, quienes utilizaron tumores sólidos en su análisis. Lograron esto a través de la aplicación directa de la técnica a las dos líneas celulares de cáncer de mama y tumores vesicales primarios con el fin de establecer el número completo de copias de los cariotipos para las células. Fueron capaces de identificar 16 regiones de amplificación diferentes, muchas de las cuales fueron descubrimientos nuevos.

Poco después, du Manoir et al. reportaron prácticamente la misma metodología. Los autores tiñeron una serie de cromosomas humanos a partir de una biblioteca de ADN con dos fluoróforos diferentes que estaban en proporciones distintas y de esta manera pusieron a prueba la técnica, también aplicaron CGH al ADN genómico de pacientes con Síndrome de Down o con leucemia prolinfocítica de células T, así como células de una línea celular de carcinoma papilar renal. Se concluyó que los coeficientes de fluorescencia obtenidos fueron exactos y que las diferencias entre el ADN genómico a partir de diferentes tipos de células fueron detectables y, por lo tanto, que CGH era una herramienta de análisis citogenético de gran utilidad.

Inicialmente, el uso generalizado de la tecnología CGH fue complicado, ya que los protocolos no estaban estandarizados y por lo tanto surgieron inconsistencias, sobre todo debido a las incertidumbres en la interpretación de los datos. Sin embargo, en 1994 se publicó una revisión en la cual se describía de manera sencilla y detallada el protocolos, y se comercializó el software de análisis de imágenes, lo que permitió que CGH se utilizara en todo el mundo. Ya que nuevas técnicas como la microdisección y la reacción en cadena de polimerasa de oligonucleótidos degradados (DOP-PCR), fue posible aplicar el concepto de CGH a anormalidades cromosómicas más pequeñas y, por lo tanto, mejorar la resolución de CGH.

La implementación de los arreglos de CGH, donde se utilizan microarreglos de ADN en lugar de preparaciones tradicionales de cromosomas en metafase, fue iniciada por Toledo et al. en 1997 con células tumorales y en 1998 por Pinkel et al. mediante el uso de células de cáncer de mama. Esto fue posible gracias al Proyecto del Genoma Humano, pues se generó una biblioteca de fragmentos de ADN clonados que tenían ubicaciones conocidas en todo el genoma humano, estos fragmentos se utilizan como sondas en el micro-arreglo de ADN. Ahora sondas de diversos orígenes tales como ADNc, productos de PCR genómica y cromosomas artificiales bacterianos (BAC) pueden utilizarse en micromatrices de ADN, que pueden contener hasta 2 millones de sondas. El arreglo de CGH es automático y permite una mayor resolución (hasta 100 kb) que CGH tradicional ya que las sondas son más pequeñas y así se pueden dirigir a regiones cromosómicas específicas si es necesario, por lo tanto el análisis es más rápido y mucho más adaptable a su uso en el diagnóstico.

## Métodos básicos

### Preparación de láminas en metafase (la metafase es una de las etapas de la mitosis y la meiosis, que son los dos tipos de división celular)

El ADN en la lámina es una muestra de referencia, y se obtiene de un hombre o una mujer cariotípicamente normal, aunque es preferente utilizar ADN femenino, ya que posee dos cromosomas X los cuales contienen más información genética que el cromosoma masculino Y. Se utiliza fitohemaglutinina de linfocitos de sangre periférica. Se añade 1 ml de sangre heparinizada a 10 ml de medio de cultivo y se incuba durante 72 horas a 37 °C en una atmósfera de 5% $CO_2,$ además se agregó colchicina para detener la mitosis en las células, estas se recuperan y tratan con solución hipotónica de cloruro de potasio y se fijaron en metanol y ácido acético a 3:1.

Una gota de la suspensión de células debe dejarse caer sobre una lámina limpiada con etanol desde una altura de aproximadamente 30 cm, esto debe llevarse a cabo a temperatura ambiente y con un 60-70% de humedad. Las láminas deben evaluarse de manera visual utilizando un microscopio de contraste de fase, se debe observar muy poco citoplasma y los cromosomas no deben estar encimados y medir de 400 a 550 bandas sin cromátidas separadas, para que al final se observen obscuros en lugar de brillantes. Después, las láminas deben secarse con aire durante la noche a temperatura ambiente, y cualquier almacenamiento necesario se debe hacer en grupos de cuatro a -20 °C, ya sea con perlas de sílice o con nitrógeno, para así lograr mantenerlas secas. Varios donadores deben ser analizados pues la hibridación puede ser variable. Hay una disposición de láminas comerciales, pero deben ser testadas antes.

### Aislamiento de ADN a partir de un tejido de prueba y uno de referencia

Se utiliza la extracción de fenol estándar para obtener el ADN de ambas muestras de tejido (de un individuo cariotípicamente normal), lo que implica la combinación del buffer Tris y el fenol con el ADN acuoso en cantidades iguales. Enseguida se realiza una separación por agitación y una centrifugación, después de lo cual se elimina el sobrenadante (capa acuosa), adicionalmente se trata con éter y, finalmente, se utiliza precipitación con etanol para concentrar el ADN.

Este proceso se puede completar con kits de aislamiento de ADN que están disponibles comercialmente y se basan en columnas de afinidad.

Preferentemente, el ADN debe extraerse de tejidos fríos o congelados, ya que esto permitirá que tenga una más ata calidad, a pesar de que ahora es posible utilizar material de archivo, que está incrustado en formol o cera de parafina, siempre que se sigan los procedimientos adecuados. Aproximadamente, 0.5-1 μg de ADN es suficiente para el análisis de CGH, aunque si no se obtiene la cantidad deseada se puede aplicar DOP-PCR para amplificar el ADN, sin embargo, en este caso, es importante aplicar DOP-PCR tanto a la prueba como a las muestras de ADN de referencia para una mayor fiabilidad.

### Ahora que los radiactivos ya casi no se utilizan, es posible preparar sondas y así sintetizar también ADN usando PCR, es decir, sintetizamos ADN in vitro, pero sin radiactivos y con precursores que todavía nos permiten tener una etiqueta.

Se utiliza Nick translation (implementado por la ADN polimerasa I) para marcar el ADN, esto implica cortarlo y subcortar los nucleótidos marcados con fluoróforos (marcaje directo) o biotina para tener anticuerpos con fluoróforos conjugados que son agregados después (marcaje indirecto). Por lo tanto, es importante comprobar la longitud de los fragmentos del ADN de referencia y de prueba, por medio de un gel de electroforesis, estos fragmentos deben estar en un rango de 500kb-1500kb para tener una hibridación óptima.

### Bloqueo

Se añade Cot-1 DNA (ADN de placenta enriquecido con secuencias repetitivas con longitud de 50-100 pb) de Life Technologies Corporation® para bloquear secuencias de ADN repetitivas normales, particularmente en los centrómeros y telómeros, si se detectan estas secuencias, la relación de fluorescencia puede reducirse y provocar pérdidas o ganancias para evitar la detección.

### Hibridación

Se mezclan 8-12 µl de cada ADN marcado (referencia y prueba) y se añaden 40 µg de Cot-1 DNA®, después se precipita y disuelve en 6 µl de mezcla de hibridación, que contiene 50% de formamida para disminuir la temperatura de fusión del ADN y 10% de sulfato de dextrano para aumentar la concentración de la sonda efectiva en una solución salina de citrato de sodio (SSC) con un pH de 7.

La desnaturalización de la lámina y las sondas se llevan a cabo por separado. El portaobjetos se sumerge en 70% de formamida y SSC 2x durante 5-10 minutos a 72 °C, mientras que las sondas se desnaturalizan por inmersión en un baño maría a 80 °C durante 10 minutos y se añaden inmediatamente a la preparación de la metafase de las láminas. Esta reacción después se cubre con un cubreobjetos y se deja durante dos a cuatro días en una cámara húmeda a 40 °C.

Después se retira el cubreobjetos y se realizan lavados de 5 minutos, tres con SSC 2x a temperatura ambiente, uno a 45 °C con SSC 0.1x y uno más usando TNT a temperatura ambiente. La reacción se pre-incuba durante 10 minutos, después se hace una segunda incubación de 60 minutos a 37 °C, tres lavados más de 5 minutos con TNT y uno con SSC 2x a temperatura ambiente. A continuación, el portaobjetos se seca utilizando etanol en series de 70% / 96% / 100% antes de la contratinción con DAPI (0,35 μg/ml), para la identificación de cromosomas y se sella con un cubreobjetos.

### Visualización de imágenes de fluorescencia

Se requiere un microscopio de fluorescencia con los filtros apropiados para la tinción DAPI así como dos fluoróforos utilizados para la visualización, estos filtros deben minimizar la diafonía entre los fluoróforos, tales como filtros de paso de banda estrecha. El microscopio debe proporcionar una iluminación uniforme sin variación cromática, ajustarse adecuadamente, tener un tipo de "plan" del objetivo que sea acromático y dar una magnificación de x63 o x100.

La imagen se debe guardar utilizando una cámara con resolución espacial de por lo menos 0.1 µm en el nivel de la muestra y la imagen debe ser de al menos 600x600 píxeles. La cámara también debe ser capaz de integrar la imagen en por lo menos 5 a 10 segundos, con una resolución fotométrica mínima de 8 bits.

Para la etapa de procesamiento de imágenes ya existe software dedicado a CGH que está disponible comercialmente y es necesario para quitar ruido de fondo, eliminar y segmentar materiales que no son de origen cromosómico, normalizar la relación de fluorescencia, llevar a cabo el cariotipo cromosómico y escalar a longitud estándar.

Un cariotipo relativo al número de copias, que presenta zonas de deleciones o amplificaciones cromosómicas se genera por un promedio de las proporciones de un número de metafases de alta calidad y el trazado a lo largo de un ideograma, un diagrama de la identificación de cromosomas basado en los patrones de bandas. La interpretación de los perfiles de relación se lleva a cabo ya sea usando umbrales fijos o estadísticos (intervalos de confianza). Al utilizar los intervalos de confianza, se identifican las ganancias o pérdidas cuando el 95% de la proporción de fluorescencia no contiene 1.0.

### Notas extras

Se debe tener extremo cuidado para evitar la contaminación en cualquier etapa que implica ADN, especialmente con el ADN de prueba ya que la contaminación de la muestra con el ADN normal puede sesgar los resultados más próximos a 1,0, por lo tanto las anomalías podrían pasar desapercibidas. Técnicas como FISH, PCR y citometría de flujo pueden emplearse para confirmar los resultados.

## Array de hibridación genómica comparativa

El array de hibridación genómica comparativa (también conocida como hibridación genómica comparativa a base de microarrays, matriz CGH, arrays CGH o aCGH) es una técnica de citogenética molecular para la detección de las diferencias en el número de copias cromosómicas entre los dos genomas, y por lo tanto localizar regiones de desequilibrios genómicos en el paciente, utilizando los mismos principios de FISH, así como el tradicional CGH.

Con la introducción del array de CGH, la principal limitación del CGH convencional, una baja resolución, fue superada. En el array de CGH, los cromosomas en metafase se sustituyen por fragmentos de ADN clonados (+100-200 kb) de los que se conoce la localización cromosómica exacta. Esto permite la detección de anormalidades con más detalle y además hace que sea posible mapear los cambios directamente sobre la secuencia genómica.

La matriz de CGH ha demostrado ser una técnica específica, sensible, rápida y de alto rendimiento, con ventajas considerables en comparación con otros métodos utilizados para el análisis de la variación en el número de copias del ADN, haciendo que sea más susceptible a su aplicación en el diagnóstico. Usando este método, la variación en el número de copias en niveles de 5-10 kilobases de secuencias de ADN puede ser detectados. Los arreglos de CGH de alta resolución (HR-CGH) son precisos para la detección de variaciones estructurales (SV) con una resolución de 200 pb. Este método permite identificar nuevos cambios cromosómicos recurrentes como microdeleciones y duplicaciones en condiciones humanas tales como cáncer y defectos de nacimiento debido a anormalidades cromosómicas

### Metodología

La matriz de CGH se basa en el mismo principio que el CGH convencional. En ambas técnicas, el ADN de una muestra de referencia (o control) y el ADN de una muestra de ensayo (o paciente) se marca con dos fluoróforos diferentes y se utiliza como sondas que se hibridan de forma competitiva a objetivos de ácido nucleico. En el CGH convencional, el objetivo es una propagación de metafase de referencia. En la matriz de CGH, estos objetivos pueden ser fragmentos genómicos clonados en una variedad de vectores (por ejemplo, BAC o plásmidos), DNA, u oligonucleótidos.

La figura 1 es una visión esquemática de la técnica del array de CGH. El ADN de la muestra a ensayar se marca con un fluoróforo rojo (cianina 5) y la muestra de ADN de referencia se marca con fluoróforo verde (cianina 3). La misma cantidad de ambas muestras de ADN se mezclan y cohibridan con un microarreglo de ADN de varios miles de fragmentos de ADN u oligonucleótidos espaciados uniformemente. Después de la hibridación, se utilizan los sistemas de imágenes digitales para capturar y cuantificar las intensidades de fluorescencia relativas de cada uno de los fluoróforos hibridados.

La relación resultante de la intensidad de fluorescencia es proporcional a la relación de los números de copias de secuencias de ADN en el ensayo y de los genomas de referencia. Si las intensidades de los fluorocromos son iguales en una sonda, esta región del genoma del paciente se interpreta como que tiene la misma cantidad de ADN en las muestras de ensayo que en las de referencia. Si existe una alteración de la proporción Cy3:Cy5 indica que existe una pérdida o ganancia del ADN del paciente en esa región genómica específica, es decir, en el caso de que el ADN contenga una duplicación se observará con mayor proporción el color verde y si hay una deleción habrá una menor proporción de sonda y se predominará el color rojo.

### Soluciones tecnológicas para el array de CGH

La matriz CGH se ha implementado utilizando una amplia variedad de técnicas. Por lo tanto, algunas de las ventajas y limitaciones de la matriz de CGH dependen de la técnica elegida. Los enfoques iniciales utilizan matrices producidas a partir de grandes clones de ADN genómico de inserción, tales como BACs. El uso de BAC ofrece señales intensas suficientes para detectar los cambios de una sola copia y localizar con precisión los límites de la anormalidad. Sin embargo, los rendimientos de los clones de BAC iniciales aislados son bajos y por lo tanto son necesarias las técnicas de amplificación de ADN. Estas técnicas incluyen PCR y amplificación por círculo rodante. Las matrices también se pueden construir utilizando ADNc. Estas matrices actualmente producen una alta resolución espacial, pero el número de los ADNc se limita por los genes que están codificados en los cromosomas, y su sensibilidad es baja debido a la hibridación cruzada. Esto da como resultado la incapacidad para detectar cambios de una sola copia a gran escala genómica. En el último enfoque las matrices están marcadas con oligonucleótidos cortos. La cantidad de oligos es casi infinita, y el tratamiento es rápido, rentable y fácil. Aunque los oligonucleótidos no tienen la sensibilidad para detectar cambios de copia única, con un promedio de las proporciones de oligos que se asignan uno junto al otro en el cromosoma puede compensarse la reducción de la sensibilidad. También es posible utilizar matrices que tienen sondas que se superponen de manera que los puntos de corte específicos pueden ser descubiertos.

### Enfoques de diseño

Hay dos enfoques diferentes para el diseño de micro-arreglos para aplicaciones de CGH, estos pueden ser de todo el genoma o específicos.

Los arreglos de todo el genoma humano están diseñados para cubrirlo por completo. A menudo incluyen clones que proporcionan una amplia cobertura de todo el genoma; y de las matrices que tienen cobertura contigua, dentro de los límites del genoma. Matrices de todo el genoma se han construido principalmente para investigación y se ha demostrado su valor excepcional en el descubrimiento de genes. También son muy valiosas en el cribado del genoma, de las ganancias y pérdidas de ADN en una resolución sin precedentes.

Los arreglos dirigidos están diseñados para una región específica (s) del genoma con el fin de evaluar que un segmento objetivo. Pueden ser diseñados para estudiar un segmento cromosómico o un cromosoma específico para identificar y evaluar las anomalías de dosificación de ADN específico en individuos con síndromes de microdeleción sospechosos o reordenamientos subteloméricos. El objetivo fundamental de un microarreglo dirigido en la medicina es proporcionar resultados clínicamente útiles para el diagnóstico, consejo genético, pronóstico y tratamiento clínico de las anomalías citogenéticas desequilibradas.

### Comparación de CGH con el cariotipo convencional

El cariotipo convencional o el análisis citogenético tienen una precisión limitada y solo pueden detectar cambios en el número y/o la estructura de los cromosomas mayores de 5 a 10 millones de pares de bases (MB). Sin embargo, con el cariotipo molecular (chips CGH), es posible detectar al mismo tiempo la adquisición o pérdida de fragmentos de ADN que son la causa de más de 300 síndromes genéticos relacionados con retraso mental, autismo, enfermedades del corazón y otras enfermedades. Por otras razones, la mayoría de ellos no pueden detectarse mediante cariotipo convencional.

## Aplicaciones

### CGH convencional

El CGH convencional se ha utilizado principalmente para la identificación de regiones cromosómicas que se pierden o ganan recurrentemente en los tumores, así como para el diagnóstico y pronóstico del cáncer. Este enfoque también puede ser usado para estudiar las anormalidades cromosómicas en los genomas fetales y neonatales. Además, se ha demostrado que el CGH convencional es eficaz en el diagnóstico de anomalías complejas asociados con trastornos genéticos humanos.

**CGH en el estudio del cáncer**

Datos de CGH de varios estudios del mismo tipo de tumor muestran patrones consistentes de anormalidades genéticas no aleatorias. Algunos de estos cambios parecen ser comunes en varios tipos de tumores malignos, mientras que otros son más específicos de un tumor. Por ejemplo, las ganancias de regiones cromosómicas lq, 3q y 8q, así como las pérdidas de 8p, 13q, 16q y 17p, son comunes en cierto tipos de tumores, como el de mama, ovario, próstata, riñón y vejiga (figura 2). Otras alteraciones, tales como ganancias 12p y Xp en el cáncer testicular, pérdida de 9q y ganancia de 13q en el cáncer de vejiga, pérdida de 14q en el cáncer renal y pérdida Xp en el cáncer de ovario son más específicos, y podrían reflejar las fuerzas de selección únicas que operan durante el desarrollo del cáncer en diferentes órganos.

Una visión general de los perfiles del número de copias del genoma para la mayoría de tipos de cáncer se presenta en el proyecto Progenetix.

**Aberraciones cromosómicas**

Cri du Chat (CDC) es un síndrome causado por una deleción parcial del brazo corto del cromosoma 5. Varios estudios han demostrado que el CGH convencional es adecuado para detectar esta eliminación, así como alteraciones cromosómicas más complejas. Por ejemplo, Levy et al. (2002) informaron acerca de un bebé con un grito de gato, el sello de la CDC, pero que tenía un cariotipo indistinto. El análisis de CGH reveló una pérdida del material cromosómico de 5p15.3 lo que confirmó el diagnóstico clínico. Estos resultados demuestran que el CGH convencional es una técnica fiable en la detección de aberraciones estructurales y, en casos específicos, puede ser más eficiente en el diagnóstico de anormalidades complejas.

### Array CGH

**Anormalidades genómicas en cáncer**

Las alteraciones genéticas y reordenamientos se producen con frecuencia en el cáncer y contribuyen a su patogénesis. La detección de estas aberraciones por medio de la matriz de CGH proporciona información sobre las localizaciones importantes de los genes del cáncer y puede tener uso clínico en el diagnóstico, el cáncer de clasificación y el pronóstico. Sin embargo, no todas las pérdidas de material genético son patogénicas, ya que un poco de material de ADN es fisiológicamente perdido durante la reordenación de subgenes de inmunoglobulina.

La matriz de CGH puede aplicar no sólo al descubrimiento de anormalidades cromosómicas en el cáncer, sino también para el seguimiento de la progresión de los tumores. La diferenciación entre lesiones metastásicas y suaves también es posible mediante FISH una vez que las anomalías fueron detectadas por el arreglo de CGH.

El sitio web arrayMap ofrece acceso a los perfiles del número de copias pre-procesados, así como las anotaciones clínicas de una decena de miles de arreglos genómicos, herramientas de visualización en línea y acceso a datos mediante programación.

**Aberraciones submicroscópicas**

El síndrome de Prader-Willi (SPW) es una anomalía estructural paterna que implica a la región cromosomica 15q11-13, mientras que una aberración materna en la misma región causa el síndrome de Angelman (AS). En ambos síndromes, la mayoría de los casos (75%) son el resultado de una supresión Mb a 3-5 de la región PWS/AS crítica. Estas pequeñas aberraciones no se pueden detectar usando citogenética o el CGH convencional, pero se pueden detectar fácilmente utilizando arreglo de CGH. Como una prueba de este principio Vissers et al. (2003) construyeron una amplia gama genomica con una resolución de 1 Mb para detectar a tres pacientes con síndromes de microdeleción conocidos, incluyendo uno con SPW. En los tres casos, las anomalías, que van desde 1,5 a 2,9Mb, se identificaron fácilmente. Por lo tanto, el arreglo de CGH demostró ser un método específico y sensible para detectar aberraciones submicroscópicas.

Cuando se utiliza la superposición de microarreglos, también es posible descubrir los puntos de interrupción que participan en las aberraciones cromosómicas.

**Diagnóstico genético prenatal**

Finalmente, también se ha generalizado el uso de esta técnica en diagnósticos prenatales, para el estudio de la presencia de determinadas alteraciones cromosómicas en el genoma del feto y en el diagnóstico genético preimplantatorio, para la selección de embriones libres de dichas anormalidades.

La aplicación del CGH en este campo, implica la previa amplificación del genoma proveniente de una única célula que será posteriormente estudiado. Aunque el cariotipo clásico es más barato, el CGH está desplazando a la citogenética clásica y al FISH debido a su rapidez, precisión, mayor resolución y por evitar el uso de cultivos celulares (y por tanto del fenómeno de mosaicismo en ellos). La mayoría de los métodos "tradicionales" de valoración de la viabilidad del embrión se basan en la evaluación morfológica del mismo en diferentes fases del desarrollo preimplantacional. No hace mucho se describió una cierta asociación entre la morfología del blastocisto y la presencia de ciertas aneuploidías, estableciéndose las bases del screening genético preimplantacional (PGS) para asesorar la viabilidad del mismo. Con la introducción del CGH en esta rutina clínica, no solo se facilita la selección de embriones sanos sin anomalías cromosómicas, sino que esta técnica permitirá mejorar la eficiencia de la fecundación in vitro aumentando la tasa de implantación de embriones y reduciendo el número de embarazos múltiples y abortos espontáneos. Además, el CGH array permitirá detectar el sexo del genoma analizado (feto) ya que permite distinguir el doble cromosoma X a través de un marcaje de XX sobre XY usando una muestra control de un individuo cuyo sexo es conocido.

## Limitaciones del CGH y del array de CGH

Una desventaja principal del CGH convencional es su incapacidad para detectar aberraciones cromosómicas estructurales sin cambios en el número de copia, como el mosaicismo, las translocaciones cromosómicas equilibradas e inversiones. Además, aunque es capaz de detectar deleciones y duplicaciones, no es capaz de identificar dónde y ni tampoco puede detectar translocaciones o inversiones balanceadas. El CGH puede detectar también únicamente las ganancias y las pérdidas relativas al nivel de ploidía. Además, las regiones cromosómicas con secuencias repetitivas de ADN corto son muy variables entre individuos y pueden interferir con el análisis de CGH. Por lo tanto, las regiones de ADN repetitivas como centrómeros y telómeros tienen que ser bloqueados con el ADN repetitivo no marcado (por ejemplo, Cot 1 DNA). Además, la resolución del CGH convencional es un importante problema práctico que limita sus aplicaciones clínicas. Aunque el CGH ha demostrado ser una técnica útil y fiable en la investigación, el diagnóstico del cáncer y los trastornos genéticos humanos, las aplicaciones implican solo anormalidades graves. Debido a la limitada resolución de los cromosomas en metafase, las aberraciones más pequeñas que 5 a 10 Mb no pueden ser detectados usando CGH. Para la detección de tales anormalidades, se requiere una técnica de alta resolución. El arreglo de CGH supera muchas de estas limitaciones. La matriz de CGH se caracteriza por una alta resolución, su principal ventaja con respecto al CGH convencional. La resolución estándar varía entre 1 y 5 Mb, pero se puede aumentar hasta aproximadamente 40 kb porque complementa la matriz con clones adicionales. Sin embargo, como en el CGH convencional, la principal desventaja es su incapacidad para detectar aberraciones que no den lugar a cambios en el número de copias y está limitado en su capacidad para detectar mosaicismo. El nivel de mosaicismo que puede ser detectado depende de la sensibilidad y resolución espacial de los clones. En la actualidad, los reordenamientos presente en aproximadamente el 50% de las células es el límite de detección. Para la detección de tales anomalías, otras técnicas, tales como SKY (cariotipo espectral) o FISH. Otra desventaja es la falta de disponibilidad comercial de las matrices. Hasta ahora, BAC y clones de cDNA pueden obtenerse de, por ejemplo, el Centro Sanger, BACPAC Recursos, Invitrogen y la investigación genética. Sin embargo, la preparación matriz todavía tiene que ser realizada por los propios investigadores. Las inconsistencias en la visualización y el software de imágenes, así como los parámetros de interpretación hacen que sea difícil para realizar repeticiones y comparaciones entre diferentes laboratorios.

