Les chevaliers de l'ordre de Saint-Jean de Jérusalem, également connu sous le nom de chevaliers Hospitaliers ou encore de chevaliers de Malte, prennent le contrôle de Malte en 1530, et en 1533 construisent un hôpital à Birgu (l'une des trois villes) pour soigner les malades. En 1565, Soliman le Magnifique, sultan de l'Empire ottoman, entreprend un grand siège de l'île avec une flotte de 180 navires et une force de débarquement de . L'ordre, avec seulement , parvient néanmoins à vaincre les Turcs ottomans après un siège de plusieurs mois. Après ce siège, l'ordre fonde la ville de La Valette sur une péninsule et la fortifie avec des murs en pierre, qui, par ailleurs, ont résisté aux lourds bombardements de la Seconde Guerre mondiale. En 1575 l'ordre construit un nouveau grand hôpital connu sous le nom de Grand Hôpital ou "Sacred Infirmary" afin de poursuivre sa mission première de soins aux malades.