Asunción a été fondée en 1537 par Juan de Salazar y Espinosa, un Espagnol et membre de l'expédition de Pedro de Mendoza qui devait coloniser le bassin du Rio de la Plata, le 15 août le jour de la fête de l'Assomption de Marie, c'est-à-dire pourquoi est nommé ainsi. C'est le plus long peuplement continuellement habité dans le bassin du Río de la Plata et au début de l'époque coloniale il a été appelé "Madre de Ciudades" (mère des villes) car c'est de là que partent de nombreuses expéditions et missionnaires pour coloniser la région fondant de nombreux autres établissements comme Corrientes, Santa Fe, Buenos Aires et Santa Cruz de la Sierra. Asunción a été établi sur la rive est d'une baie calme dans la rivière Paraguay, ce qui en fait un bon poste de surveillance. En 1541, le premier "Cabildo" (conseil municipal) a été créé pour transformer Asunción d'un fort militaire en une ville civile avec un gouvernement local.