The basic concept of vascular tissue engineering, consists of three elements, which include: (1) scaffolds, either biological or synthetic, onto which the extracellular matrix (ECM) is organized in neo-tissue formation, (2) cells, either seeded in vitro or mobilized in vivo, and (3) signals, biochemical and biomechanical. All these three factors are interdependent and are indispensable to the formation of highly organized vascular tissue. The use of either biodegradable synthetic or biological scaffolds, on which cells can be grown, is the basis for the classical tissue-engineering paradigm. Cellular growth and differentiation, in either two-dimensional or three-dimensional cultures, require the presence of a structured environment which promotes the cell growth. Extracellular matrix has a highly organized structure. Eventually, the tissue-engineering scaffolds are replaced by the ECM secreted by the cells thus forming completely functional neo-vessels. The ECM consists of a complex mixture of structural and functional proteins playing an important role in tissue and organ morphogenesis, in maintenance of cell and tissue structure and function, and in host response to injury. ECM is composed of the type I and VI collagens, glycosaminoglycans, fibronectin, laminin, elastin, etc.
In this thesis, biological and multi-layered “composite” small-diameter vascular grafts were developed.
The biological acellular ECM-based scaffolds consisted of small-diameter tibial calf arteries and veins which were decellularized by a detergent-enzymatic method (a modified version of Meezan protocol) able to remove all the cellular components from tissue. The decellularized vessels were investigated in order to establish the influence of the decellularization procedure on their structure and on their mechanical properties. Furthermore, some acellular biological vessels were not only decellularized but also reinforced by cross-linking treatment with poly(ethylene glycol) diglycidyl ether. The detergent-enzymatic method can be considered a simple and valuable procedure for the preparation of acellular vascular grafts (AVGs), preserving a high degree of collagen and elastic fibers. Moreover, the protocol can be considered effective to remove HLA class I antigen expression, responsible for immune reactivity. The cross-linking treatment, however, provides appropriate mechanical reinforcement of the acellular constructs with results comparable to bovine native vessels. Histological and morphological analysis confirmed the ability of the Meezan’s decellularization protocol to preserve native extracellular matrix histoarchitecture and components.
Mimicking the natural architecture of native blood vessels, three-layered vascular grafts (TLVGs) were developed. The engineered artificial vessels, whose core was composed of poly-L-lactide acid (PLLA), were coated, internally and externally, with ECM proteins to support cell adhesion. The ECM proteins belonged to bovine aorta which was previously decellularized through the Meezan protocol. Decellularized aortic matrix was characterized by bi-dimensional electrophoresis and subsequent LC-MS/MS analysis in order to identify the ECM protein components of decellularized aorta. The proteomic analysis demonstrated the presence of type I and VI collagens, vimentin, myosin, actin and tropomyosin, while the histological analysis of the decellularized aortic matrix revealed the presence of proteoglycans, collagens and muscular fibers. The layered deposition technique can be considered a valu¬able method to obtain layered vascular scaffolds of different sizes and with a good compromise between stiffness and elasticity for optimal cell organization. Moreover, the microporous intermediate PLLA layer was found responsible for scaffold resistance.
Furthermore, the bovine aortic ECM was used as an internal layer in bi-layered vascular grafts (BLVGs), made of PVA hydrogel. The elasticity and suturability of the bi-layered constructs were enhanced in respect to the triple layered scaffolds. The hydrogels were also prepared using partially oxidized PVA in order to improve the biodegradability of the constructs.
AVGs, TLVGs and BLVGs proved to have good mechanical properties, evaluated by the uniaxial tensile measurement. The decellularization process influenced the physical characteristics of AVGs in relation to diameter and wall-thickness. External diameter and wall-thickness decreased in acellular arteries in respect to native ones, but remained constant in acellular veins. Moreover, the cross-linking treatment with poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, subsequent to a short proteolytic treatment with trypsin, increased both tensile modulus and ultimate tensile strength (0.98 MPa and 3.95 MPa, respectively) of AVGs without significantly affecting the deformability. These values are comparable to native bovine arteries and veins (around 1 MPa). The Young's modulus of triple layered vascular grafts (1.8 MPa) was comparable to that of human saphenous or femoral vein (1.50 MPa), despite the microporosity of the PLLA layer. Scaffold strength provides the firmness to resist cell contraction forces, whereas elasticity enables better communication between cells, facilitating parallel organization. The good compromise between stiffness and elasticity of the microporous PLLA layer ensured the maintenance of a tubular shape in the triple layered constructs. These findings may be interesting for various tissue engineering applications when scaffold and cells interact and influence each other, while integrating into engineered tissue. Mechanical, physical and chemical properties of partially oxidized PVA were also investigated. Mechanical tests showed a high elasticity of PVA constructs (0.11 ± 0.03 MPa) in respect to the TLVGs and a decrease of elasticity increasing the oxidation levels (1% and 2%). Moreover, differential scanning calorimetry showed a lower presence of crystallinity and a lower melting point when there was an increase in oxidation level. Carbonyl content was evaluated by a dinitrophenylhydrazine test.
In order to test the cytocompatibility of AVGs and TLVGs, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and human aortic smooth muscle cells (HAoSMCs) were seeded in in vitro static conditions on internal and external scaffold surfaces, respectively. After 7 days of culture, decellularized cross-linked AVGs demonstrated to have a good cytocompatibility which was evaluated with different in vitro culture trials. In TLVGs, however, the ECM layers provided suitable stimuli for cell adhesion and proliferation and supported the adhesion and growth of both endothelial and smooth muscle cells, which were seeded with an in vitro co-culture for 7 days. In vivo implants of BLVGs on femoral arteries of Sprague Dowley rats are in progress to test suturability properties, cell adhesion, cytocompatibility and immunohistochemistry. Moreover, the decellularized cross-linked AVGs were seeded with HAoSMCs on theirs external surface and cultured in dynamic conditions using a rotary bioreactor system, which was designed for the purpose. HAoSMCs culture on a tubular acellular matrix allowed for an easy and highly efficient cell growth in dynamic conditions. The bioreactor worked properly and no contamination was observed during the whole culture period. After 72 h, HAoSMCs formed a complete monolayer all over the matrix and aligned in the direction of rotation.
To investigate the relationship between porosity and angiogenic properties of polymeric scaffolds, a four month study has organized in collaboration with Prof. Jockenhoevel’s research team in the Helmholtz Institute of Aachen (Germany). The project involved a study of the characterization of the human fibrin, a natural polymer, in order to evaluate how the changes in chemical structure could influence its physical and mechanical properties. Dialyzed and non-dialyzed fibrinogens were studied. The degradation rate, the mechanical properties (i.e. burst strength pressure) and the filtration rate of human fibrin, which was prepared using different fibrinogen concentrations and brands, were investigated. Morphologically, a lower dialyzed and non-dialyzed fibrinogen concentration was characterized by thicker and less dense fibrin fibers, with a high filtration rate evaluated by a bioreactor system (CapNet system), suitable for studying this property. Dialysis affected the separation of fibrin fibers, due to the chemical removal of all the components with a molecular weight between 6000 and 8000 Dalton. The mesenchymal stromal cells (MSCs) adhered to and grew on and among the fibers dissolving them along the attachment on the substrate, probably due to biochemical signals released by cell-fibrin interactions. Moreover, mechanical tests on fibrin gels showed high values of burst strength pressure of dialyzed fibrin gels in respect to the non-dialyzed ones, which further increased after cell seeding. No evident differences on the degradation tests between the two different fibrin gels were observed. Cytocompatibility of the fibrin gels showed an optimal adhesion of MSCs cultured on gels.
Nell’ingegneria tessutale vascolare, la formazione di un neo-tessuto è resa possibile dalla relazione tra: (1) scaffolds, biologici o sintetici, (2) cellule, sia seminate in vitro che reclutate in vivo, e (3) segnali, biochimici e biomeccanici. Tutti questi fattori sono interdipendenti e indispensabili per la formazione di un tessuto vascolare altamente organizzato. L’uso di scaffolds biologici o sintetici biodegradabili, su cui le cellule possano crescere, è un concetto che sta alla base dell’ingegneria tessutale classica. La presenza di un ambiente strutturato e funzionale è in grado di consentire la crescita e il differenziamento cellulare, in colture sia bidimensionali che tridimensionali. A questo proposito, la matrice extracellulare (ECM) si presta bene come scaffold per l’ingegneria tessutale, essendo ben strutturata e altamente organizzata. L’ECM, infatti, consiste in un complesso di proteine strutturali e funzionali che ricoprono un ruolo importante nella morfogenesi di organi e tessuti, nel mantenimento delle loro strutture e funzioni, e nella risposta da corpo estraneo. Essa è composta, tra l’altro, da collagene di tipo I, collagene di tipo VI, laminina, fibronectina, elastina, glicosaminoglicani, etc.
In questo lavoro di Tesi, sono stati realizzati scaffolds vascolari di piccolo diametro sia biologici che “compositi” multi-strato.
Gli scaffolds biologici acellulari a base di ECM sono stati realizzati mediante l’applicazione di un metodo di decellularizzazione detergente-enzimatico (protocollo di Meezan, leggermente modificato) ad arterie e vene tibiali bovine di piccolo diametro. Il metodo si è rivelato efficace nella rimozione della componente cellulare dai tessuti, e ne è stata indagata l’influenza sulla struttura e sulle proprietà meccaniche dei vasi studiati. A tale scopo, alcuni vasi biologici bovini sono stati non soltanto decellularizzati, ma anche rinforzati con un trattamento a base di poli(etilen glicole) diglicidil etere. Il metodo detergente-enzimatico ha consentito, dunque, la preparazione di sostituti acellulari vascolari (AVGs), preservando le componenti basilari della ECM e rimuovendo sia la componente cellulare sia l’antigene HLA di classe I, responsabile della reazione immunitaria da corpo estraneo. L’analisi istologica e morfologica ha confermato la capacità del protocollo di decellularizzazione Meezan di preservare l’istoarchitettura e numerosi componenti della ECM. Inoltre, il trattamento di cross-linking si è dimostrato in grado di rinforzare strutturalmente i costrutti acellulari, mostranti, dal punto di vista meccanico, valori comparabili a quelli dei vasi nativi bovini.
Mimando la naturale architettura dei vasi sanguigni naturali, sono stati realizzati sostituti vascolari a tre strati (TLVGs). I vasi artificiali ingegnerizzati sono stati realizzati creando uno strato composto da acido poli(L-lattico) (PLLA), ricoperto internamente ed esternamente con proteine di ECM per supportare l’adesione cellulare. In questo caso, l’ECM utilizzata è stata ottenuta da aorta bovina, la quale è stata decellularizzata seguendo, ancora una volta, il protocollo Meezan. Per identificarne i componenti proteici presenti, la matrice extracellulare di aorta è stata sottoposta a elettroforesi bidimensionale, seguita dall’analisi LC-MS/MS delle bande proteiche ottenute. L’analisi proteomica ha evidenziato la presenza di collagene di tipo I e VI, vimentina, miosina, actina e tropomiosina. Sulla stessa matrice di aorta decellularizzata, l’analisi istologica ha evidenziato la presenza di proteoglicani, collagene e fibre muscolari. La tecnica di deposizione ‘a strati’ può essere considerata una metodica valida per l’ottenimento di scaffolds vascolari stratificati di differenti dimensioni e con un buon compromesso tra rigidezza ed elasticità per l’organizzazione ottimale delle cellule. Inoltre, lo strato intermedio microporoso in PLLA conferisce la resistenza meccanica necessaria a questo tipo di scaffold.
La ECM aortica bovina è stata utilizzata anche come strato interno nei sostituti vascolari a doppio strato (BLVGs), rivestiti da idrogel di polivinil alcool (PVA). Il cambio di polimero ha consentito il miglioramento sia dell’elasticità che della suturabilità di questi costrutti rispetto a quelli a triplo strato. Gli idrogeli sono stati, inoltre, preparati utilizzando anche il PVA ossidato al fine di migliorare la loro biodegradabilità.
Le proprietà meccaniche di AVGs, TLVGs e BLVGs sono state valutate mediante la misura della tensione uniassiale e hanno mostrato risultati comparabili ai valori dei vasi nativi, sia animali che umani. Il processo di decellularizzazione ha influenzato le caratteristiche fisiche di AVGs, quali il diametro e lo spessore delle pareti. Il diametro esterno e lo spessore delle pareti sono diminuiti nelle arterie acellulari rispetto a quelle native, mentre sono rimasti costanti nelle vene acellulari. Il trattamento di cross-linking con poli(etilen glicole) diglicidil etere, successivo a un breve trattamento proteolitico con tripsina, ha incrementato sia il modulo di tensione che la resistenza a rottura di AVGs (0.98 MPa e 3.95 MPa, rispettivamente) senza influire significativamente sulla deformabilità. Questi valori sono risultati comparabili a quelli di arterie e vene bovine native (attorno a 1 MPa). Il modulo di Young dei sostituti a triplo strato (1.8 MPa) si è rivelato, invece, comparabile a quello della vena safena o femorale umana (1.50 MPa), nonostante la microporosità dello strato in PLLA. La resistenza di uno scaffold fornisce, in genere, la solidità necessaria per resistere alle forze di contrazione cellulare, mentre l’elasticità consente una migliore comunicazione tra le cellule, facilitando la loro organizzazione. Lo strato in PLLA, avendo un opportuno grado di rigidità ed elasticità, ha anche assicurato il mantenimento di una forma tubulare nei costrutti a triplo strato. Questi risultati possono essere ritenuti interessanti per varie applicazioni nel campo dell’ingegneria tessutale, specie quando scaffolds e cellule interagiscono e si influenzano vicendevolmente nel mentre si integrano col tessuto ingegnerizzato. Le proprietà meccaniche, fisiche e chimiche del PVA parzialmente ossidato sono state, altresì, investigate. I tests meccanici hanno mostrato una maggiore elasticità dei costrutti in PVA (0.11 ± 0.03 MPa) rispetto a quelli a triplo strato, mostrando un decremento dell’elasticità al crescere del grado di ossidazione (1% e 2%). Inoltre, la calorimetria a scansione differenziale ha mostrato la presenza di cristallinità e un punto di fusione più bassi al crescere del grado di ossidazione del materiale. Il contenuto di gruppi carbonilici è stato valutato mediante il test con dinitrofenilidrazina.
Al fine di testare la citocompatibilità di AVGs e TLVGs, cellule endoteliali umane isolate da cordone ombelicale (HUVECs) e cellule aortiche muscolari lisce umane (HAoSMC) sono state seminate in condizioni statiche in vitro sulle superfici interne ed esterne, rispettivamente, degli scaffolds realizzati. Dopo 7 giorni di coltura, gli AVGs decellularizzati e cross-linkati hanno mostrato di possedere una buona citocompatibilità, valutata effettuando esperimenti in vitro sia in condizioni statiche, utilizzando entrambe le tipologie cellulari citate su differenti scaffolds, sia in condizioni dinamiche, utilizzando soltanto le HAoSMCs in un bioreattore a rotazione costruito per lo scopo. La coltura di HAoSMCs sulla superficie esterna della matrice acellulare tubulare ha consentito la crescita cellulare in modo semplice e altamente efficace in condizioni dinamiche. Il bioreattore ha lavorato correttamente e in assenza di contaminazione durante l’intero periodo di coltura. Dopo 72 h, le HAoSMCs hanno formato un monostrato completo su tutta la matrice, disponendosi lungo la direzione di rotazione. Nei TLVGs, invece, gli strati di ECM hanno fornito stimoli adatti all’adesione e alla proliferazione cellulare e hanno supportato l’adesione e la crescita delle cellule endoteliali e delle cellule muscolari lisce, seminate per 7 giorni in co-coltura in vitro. Impianti in vivo di BLVGs su arterie femorali di ratti Sprague Dowley sono in corso e serviranno per testare l’efficacia dei costrutti.
Al fine di investigare la relazione tra porosità e proprietà di scaffolds polimerici, è stato condotto uno studio in collaborazione con il gruppo di ricerca del Prof. Jockenhoevel presso l’Helmholtz Institute di Aachen (Germania) durante un periodo di stage di circa quattro mesi. Il progetto ha riguardato lo studio di caratterizzazione della fibrina umana, un polimero naturale, al fine di valutarne le proprietà fisiche e meccaniche in seguito ai cambiamenti chimici strutturali indotti. Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando fibrinogeni umani commerciali sia dializzati che non dializzati, a diverse concentrazioni. Dal punto di vista morfologico, il fibrinogeno a bassa concentrazione (5 mg/mL), indipendentemente dalla dialisi, determina la formazione di gels di fibrina caratterizzati da fibre più spesse e meno dense. Inoltre, la velocità di filtrazione, valutata con uno specifico bioreattore capillare, il CapNet system, è risultata maggiore nei gels di fibrina preparati con un fibrinogeno a bassa concentrazione (5 mg/mL) rispetto a quelli preparati ad una più elevata concentrazione di fibrinogeno (10 mg/ml). La dialisi, invece, ha influenzato il grado di separazione delle fibre di fibrina, attribuibile all’eliminazione di composti con peso molecolare al di sotto di 6000-8000 Dalton. Sono state studiate, inoltre, la velocità di degradazione e le proprietà meccaniche (es. lo sforzo a rottura per applicazione di una pressione) dei gels di fibrina. In particolare, i gels preparati con il fibrinogeno dializzato hanno mostrato una maggiore resistenza a rottura, incrementata ulteriormente dalla presenza di cellule seminate su di essi; mentre, dal punto di vista della valutazione della degradazione, non sono state osservate sostanziali differenze tra i gels di fibrina dializzati e non dializzati. La citocompatibilità di entrambe le tipologie di gels è stata testata, osservando l’ottimale adesione di cellule mesenchimali stromali seminate su di essi, risultante evidente nella compenetrazione cellulare attraverso le fibre di fibrina.