Mascherano pelasi Argentiinan maajoukkueessa 147 kertaa ja on maan historian toiseksi eniten otteluita tehnyt pelaaja (Lionel Messin jälkeen). Debyyttinsä jälkeen vuonna 2003 hän edusti maata viidessä Copa América -turnauksessa, jossa hän pääsi toiseksi vuonna 2004.
, 2007, 2015 ja 2016 sekä neljä FIFA:n MM-kisoja, pääsivät vuoden 2014 finaaliin. Hän voitti kahdesti kultamitalin kesäolympialaisissa, vuonna 2004 ja 2008, ja hänestä tuli ensimmäinen miesjalkapalloilija, joka saavutti tämän kaksinkertaisen saavutuksen unkarilaisen puolustajan Dezső Novákin jälkeen vuonna 1968. Vuosina 2008-2011 Mascherano toimi Argentiinan kapteenina.