Sam Holbrook ha iniziato la sua carriera da arbitro nell'Appalachian League nel 1990, seguita da periodi in Midwest, Carolina, Texas, Eastern e International League prima di fare il suo debutto in Major League nel giugno 1996. Holbrook ha lavorato la stagione 1996 nell'American League, seguita da tre stagioni nella National League. Nel 1999, è stato uno dei 22 arbitri le cui dimissioni sono state accettate (in una tattica di negoziazione sindacale fallita), ed è stato riassunto nel 2002, arbitrando partite in entrambe le Major League da allora. Holbrook ha arbitrato in cinque Division Series (2005, 2007, 2010, 2013, 2019), quattro League Championship Series (2008, 2009, 2011, 2012) e tre World Series (2010, 2016).
, 2019). Ha anche arbitrato la MLB All-Star Game del 2004. Holbrook è stato nominato crew chief nel febbraio 2017 dalla MLB. Nel suo team del 2017 si sono uniti Greg Gibson, Jim Wolf e D.J. Reyburn.