Lo scoppio della Seconda Guerra Mondiale in Europa nel settembre 1939 vide parte dello squadrone schierato su pattuglie costiere anti-sottomarino e anti-nave da Madras, prima che il 1 ottobre 1939 lo squadrone diventasse una scuola di addestramento al volo per addestrare piloti per l'Indian Air Force, operando biplani de Havilland Tiger Moth e Hawker Hart e Wapitis, e con base a Risalpur. Molti degli ex piloti operativi dello squadrone furono impiegati nel trasporto di bombardieri Bristol Blenheim dall'Egitto all'India e all'Estremo Oriente, e nel gennaio 1941 i Blenheim iniziarono ad essere consegnati allo squadrone, consentendo a un 27° squadrone equipaggiato con Blenheim di essere separato dalla scuola di addestramento a febbraio e inviato a Singapore. I Blenheim dello squadrone erano aerei Mk IF, dotati di un cannone sotto la fusoliera per l'uso come caccia a lungo raggio e notturno, e erano gli unici caccia notturni della RAF in Estremo Oriente. Lo squadrone si trasferì a Butterworth nel maggio 1941 e a Sungai Petani nell'agosto dello stesso anno. Il Giappone invase la Malesia.
L'8 dicembre 1941, il 27° Squadrone ha lanciato otto Blenheim quella mattina per attaccare le navi giapponesi. Tuttavia, il maltempo impedì loro di individuare qualsiasi nave giapponese e gli attacchi aerei su Sungai Petani quel giorno distrussero l'aeroporto e lasciarono lo squadrone con solo quattro aerei in condizioni di volare. Fu evacuato a Butterworth quella sera. I restanti velivoli furono riportati a Singapore entro il 12 dicembre, dove, insieme ad alcuni Blenheim Is di altri squadroni, operarono sotto il nome di 27 Squadron. I rimanenti Blenheim con base a Singapore, compresi quelli del 27° Squadrone, furono evacuati a Sumatra dal 23 gennaio 1941, finendo per operare da Palembang. Il 14 febbraio quattro dei suoi Blenheim attaccarono le navi giapponesi che invadevano Sumatra, con la perdita di due Blenheim, con tutti gli aerei in condizioni di volare evacuati a Java il 15 febbraio. Qui lo squadrone cessò di esistere.