Després que l'estat de Mississipí es separés just abans de l'inici de la Guerra Civil, Barksdale va dimitir del Congrés per convertir-se en ajudant general, i després quartermaster general, de la milícia de Mississipí, amb el rang de general de brigada, amb data de rang 1 de març de 1861. L'1 de maig va ser nomenat coronel de l'Exèrcit dels Estats Confederats de la 13a Infanteria de Mississipí, un regiment que va liderar a la Primera Batalla de Bull Run aquell estiu, i la Batalla de Ball's Bluff a l'octubre. La primavera següent, va portar el seu regiment a la península de Virgínia i va lluitar en la campanya de la península i les batalles dels set dies. Quan el seu comandant de brigada, el general de brigada Richard Griffith, va ser mortalment ferit a la Batalla de Savage's Station
El 29 de juny de 1862, Barksdale va assumir el comandament de la brigada i la va conduir en una heroica, però sagnant i fútil, càrrega a la Batalla de Malvern Hill. La brigada es va conèixer com "la brigada de Barksdale al Mississipí". Va ser ascendit a general de brigada el 12 d'agost de 1862.