El 2 de maig de 1866, va participar en la Batalla d'Estero Bellaco, una depressió de terreny per la qual les aigües del riu Paraná s'uneixen a les aigües del riu Paraguai, on l'enemic va començar a retardar les tropes aliades, buscant una millor posició per lluitar. El 24 de maig de 1866, va estar present a la Batalla de Tuyutí
, el combat més gran d'Amèrica del Sud, en el qual va jugar un paper important en el comandament del centre del dispositiu militar de l'exèrcit brasilèr contra l'atac paraguayà. Va registrar a l'Ordre del Dia #56: "La glòria és la recompensa més preciosa dels valents". El 15 de juliol de 1866, encara a Tuyuti, els aliats esperaven l'arribada de les forces del Comte General de Porto Alegre, mentre que l'enemic fouxeava diàriament. Ferit greument en la batalla i insatisfet amb el llarg període de la tropa estacionada, Osório va passar el comandament de les tropes brasileres al general Polidoro da Fonseca Quintanilha Jordão.